【#东航空难第六场发布会8个要点#：涉乘客身份确认、黑匣子搜寻进展】3月26日下午，东航MU5735航班坠毁第六日，国家应急处置指挥部举行第六场新闻发布会。
发布会披露，尚未发现幸存者和第二个黑匣子（飞行数据记录仪），已搜寻到与第二个黑匣子安装位置较近的一部紧急定位发射仪（ELT）； 搜集到飞机残骸和碎片累计24047件，并设立残骸仓库，以便后续分类和分析。
经公安机关刑事技术部门工作，共确认120人身份，其中乘客114名，机组人员6人；理化实验室累计受理了66份检材，完成检验41份，均未检出常见无机炸药的主要离子成分，也未检出常见有机炸药成分。
截至26日12点，当地累计接待80名失联人员来梧家属共计493人，555人次，涉及17个省，74户家庭，累计安排家属478人到现场凭吊。上门安抚家属3800人次，开展心理评估747人次，开展心理辅导1182人次。
发布会介绍，因核心区附近地层受到较大冲击加之降水影响，边坡区域地质灾害风险较高，需要进一步制定精细化的开挖方案，应急指挥部在保证必要人力投入的同时也加大了技术投入。
1、搜集到飞机残骸和碎片累计24047件，并设立残骸仓库
发布会上，民航局安全检察专员、防控安全办公室主任朱涛表示，今天是事故发生的第六天，搜寻工作仍在进行中。截止3月26日12点，应急处置指挥部累计出动搜救人员10723人次，尚未发现幸存者和第二个黑匣子，搜寻到飞机残骸和碎片累计24047件，并设立残骸仓库，以便后续分类和分析。目前，搜救工作面临较大难度，因核心区附近地层受到较大冲击加之降水影响，边坡区域地质灾害风险较高，需要进一步制定精细化的开挖方案，应急指挥部努力克服困难，在保证必要人力投入的同时也加大了技术投入。
一方面通过无人机扫描、雷达等技术手段为搜救提供支持，对核心区进行精细化重点挖掘和残骸识别，另一方面协调组织专业力量，对核心外围和飞机坠落路线沿途大范围开展拉网式搜寻。
2、搜寻到与第二个黑匣子安装位置较近的一部紧急定位发射仪（ELT）
朱涛介绍，目前已搜寻到与第二个黑匣子安装位置较近的一部紧急定位发射仪（ELT）。
在家属救援善后工作方面，按照一人一专班的原则，继续做好家属的安抚、心理辅导和遗骸遗物认领工作，及时处理家属诉求。
截至26日12点，累计接待80名失联人员来梧家属共计493人，555人次，涉及17个省，74户家庭，累计安排家属478人到现场凭吊。上门安抚家属3800人次，开展心理评估747人次，开展心理辅导1182人次。在开展搜寻工作的同时，疫情防控工作也毫不放松，应急指挥部协调加强了现场消杀和现场人员防护用具的配备，同时严格落实每天一检的疫情防控流程，自3月25日15点—26日10点，在事故应急处置工作区域共设置核酸检测点31个，核酸检测2534人次。
3、完成检验的检材均未检出常见炸药成分
广西壮族自治区消防救援总队长郑西介绍，一方面，根据指挥部的指令，我们与交通运输、自然资源部门派到现场的大型机械作业队伍协同作战，搜集飞机残骸、遗骸、遗物和各类物证资料。同时，对前期搜寻过的事故核心区域、山头、丛林多次反复筛查，展开拉网式多层次的搜索。另一方面，根据事故现场直线距离约15公里的四旺村发现坠落飞机残骸的情况，我们派出了4个外围搜索组携带无人机、4G单兵图传、卫星电话等装备，以核心区为起点，通过搭乘摩托车、徒步行进等方式进入了7个沿线村屯的周边区域，以无人机超视距飞行侦查、红外热成像搜索、信息测绘标注、重点区域超低空核查和精细化建模等方式，沿客机飞行航线途径的约750亩面积区域开展了搜索工作。
目前，我们首批到场的消防救援力量已经连续工作了6天，参与队伍各级指挥员身先士卒，始终在一线组织开展救援工作，全体消防救援人员搜集范围累计超过24万平方米，搜集到部分遗体残骸和机体残骸，抽排积水1500立方，搭建洗消区，为现场作业人员完成洗消6000余次，开挖排水沟渠90米。
考虑到连日降雨，气温骤降骤升，烈日暴晒等因素的增加，对现场救援人员体力消耗的影响，为了保持队伍的战斗力，昨天晚上广西消防救援总队又下达命令，从贵港、来宾、贺州三个支队新调集了300名消防救援人员增援一线，今天中午第二批消防救援力量全部抵达藤县，已完成了任务交接，投入到搜救工作当中。
近日来，公安机关刑事技术部门出动220人，组成了29个勘察组，开展现场勘察、搜救和检验工作，共确认120人身份，其中乘客114名，机组人员6人，相关工作还在继续进行。理化实验室累计受理了66份检材，完成检验41份，均没有检出常见无机炸药的主要离子成分，也没有检出常见有机炸药成分。
4、民政部门对接收的遇难者遗骸、物品均已妥善保管
广西壮族自治区消防救援总队长郑西介绍，自治区民政厅殡葬服务人员已到场协助开展工作，民政部门对接收的遇难者遗骸、物品均已妥善保管。自然资源部门完成了对搜救区及其附近一带68平方公里的地质灾害风险情况调查评估，继续开展现场核心区雷达探测工作，探测面积约1500平方，共有7条坡面，探测结果已提交指挥部。追加搜救区及其附近一带的短临精细物地质灾害气象风险预警预报5次，地质灾害应急监测设备安装布点踏勘，搜寻核心区三维影像图及1：500的地形图，配合开挖方案，对开挖两侧的斜坡稳定性进行评价，为开挖方案提供参考依据。
卫生健康部门制订了加强和规范事故核心区消毒工作的方案，对核心区工作人员提出了明确要求，包括进出人员的规定，防护和现场作业人员的应急处置，严格规定消毒剂使用方法，规定核心区消毒措施和步骤，对指挥部莫埌村点，办公场所、医疗点、卫生间、广场、临时垃圾堆放点以及核心区外围的工作区、修整区、家属祭拜区等临时场所进行全面彻底的消毒，消毒面积累计3500平方米。
核心区洗消池已加放消毒剂，并对离开核心区的人员开展洗消工作。
5、东航成立专班对9名失联机组人员家属开展安抚工作
发布会上，东航集团宣传部部长刘晓东刘晓东表示：此次事故中我们有9位飞行、乘务和空保的同事失联，这几天来许多同事通过不同的方式表达了对机组人员的哀思，对家属的慰问。事件发生后，东航云南有限公司第一时间成立了专班，对9名失联机组的家属开展了安抚工作，派员进行陪护和心理疏导，公司管理人员多次上门进行慰问，帮助家属解决实际困难和生活问题，开展善后事宜。
同时，社会各界也给予了许多关心和帮助，我本人也曾经在云南公司工作过，此时此刻我想所有东航人的心情和我是一样的，都会与机组人员和家属站在一起，渡过最艰难的时刻。
6、现场有一定浓度的可燃气体，处于安全范围内
发布会上，广西壮族自治区消防救援总队后勤装备处副处长包庆斌表示，3月21日，接到救援指令后，救援总队紧急调集抢先救援车、化学洗消车等特种车辆164辆，抢险救援器材保障物资等2万余件套参与搜救工作。
在救援初期，采用空地联合，在空中使用无人机挂载热成像模块对事故区域进行快速搜索和航拍建模，为科学划分搜索区域提供依据。在地面，使用雷达生命探测仪，手持式红外热成像仪，通过微功率超宽带雷达、红外辐射探测技术进行生命迹象搜寻。
我们调派了消防救援人员搜救工作，在陡峭山坡区域运用绳索缓降、八爪鱼系统等系统辅助开展作业。我们发现主撞机点有航空燃油、液压油渗透土层，现场有一定浓度的可燃气体。
为此，我们使用六合一复合气体探测仪对核心区进行气体浓度监测，防止因可燃、有毒气体泄露引发次生灾害。目前，核心区气体监测数值均处于安全范围以内。
为解决因降雨导致的事故核心区积水问题，我们调派了10台次手抬机动泵进行抽水作业，累计抽排核心区积水1500立方米，保障了核心区搜救作业的正常进行。针对事故现场道路狭窄，路面泥泞，大型消防车辆难以行进这一问题，应急管理部消防救援局和广西消防救援总队调派多功能保障车和3辆全地型车，开展物证转移工作。
随着救援工作推进，我们根据救援现场环境变化，不断升级防疫洗消等级，调集了防化洗消车、洗消账篷、洗消药剂、洗消泵、喷雾机等车辆装备，在任务区设立三级洗消站，累计洗消6000余人次，6000余件套装备。
7.核心区西侧约12公里发现一块飞机残片
发布会披露，调查人员24日在勘验此前在水田中发现的飞机残片时，有邻村村民反映在自家的果园中发现了另一块疑似残片。调查人员在位于核心区西侧约12公里的藤县藤州镇礼秀村鸡头山果园发现一块长约8厘米、宽约3厘米的长方形复合材料残片，该残片位于水田中发现的残片北侧约2.3公里。初步判断该残片是水田中发现的弧形残片的一部分。
8、来梧需持48小时内核酸检测阴性证明
广西壮族自治区梧州市副市长苏颖在发布会上表示：事故发生以来，我们坚持人民至上，生命至上，统筹抓好疫情防控和事故应急处置工作。始终坚持既严格又体现人文关怀的疫情防控措施，目前全市疫情防控形势总体平稳有序。
一是及时出台疫情防控相关指导性文件，事故应急处置指挥部组织专家制定了《关于加强新冠肺炎疫情防控工作的指导意见》、《关于飞行事故现场作业人员疫情防控方案》、《飞行事故应急处置指挥部人员核酸检测方案》等五个文件，抓实抓细各项疫情防控工作。
二是守好入口关。加强入梧通道的管理服务，在机场、火车站、高速路口、动车站、口岸码头等设置便民核酸采样点，落实排查管理措施，查验健康码、行程码、核酸检测阴性证明，严守空中、陆路、水路三路防线。
三是落实人、物、环境同防，人员方面，我们在每一个定点接待酒店都设置了一个疫情防控指导组，由疾控、卫生监督等专业人员指导酒店开展疫情防控工作，确保定点接待酒店做好三码联查、提问监测等工作，为来梧支援、现场搜救、旅客家属、接待酒店工作人员等11类人员提供每日核酸检测服务。
3月21日以来，累计检测17373人次，其中旅客家属991人次，目前结果均为阴性。事故处置期间，对所有工作人员在严格落实健康监测的基础上，实施住宿点、工作地的相对封闭、闭环管理。酒店方面，在各接待酒店等设置了便民核酸检测点31个，对重点场所开展预防性消毒，累计消毒面积42万平方米，事故现场设立4个简易洗消站点，累计进行现场消杀面积达到3.87万平方米。
当前疫情防控形势严峻，自21日以来，事故应急处置有来自近20个省市的各方人员陆续抵梧，人员数量大，流动性强，给疫情防控工作带来很大的挑战。在此，我们请广大市民朋友继续做好戴口罩、保持社交距离等个人防护和健康监测，减少流动和聚集，积极配合开展核酸检测，落实疫情防控的要求。同时，呼吁关心此次事故的社会各界人士通过新闻了解关注，非必要不要来梧州。
根据当前疫情防控形势，对于来梧人员我们建议：
来梧前，一是中高风险地区被判定为密接者、次密接者、黄码、红码人员等暂缓来梧；二是来梧需持48小时内核酸检测阴性证明，同时健康码为绿码，行程码无显示中高风险区旅居史；三是按照疫情防控的有关事项，落实每天监测自身健康状况的要求。
到梧后，需健康申报，出示广西健康码、行程码，48小时内核酸检测阴性证明等，配合属地做好疫情防控的分类健康管理和相对闭环管理，并做好核酸检测、体温监测等疫情防控措施。
离梧前，在48小时内进行一次核酸检测，自离开梧州到抵达目的地期间，加强疫情防控的个人防护，继续遵循疫情防控关于卫生和社交距离的规定和要求。具体疫情防控的要求，可咨询梧州市疾控中心，咨询电话0774-3863725。
发布会披露，尚未发现幸存者和第二个黑匣子（飞行数据记录仪），已搜寻到与第二个黑匣子安装位置较近的一部紧急定位发射仪（ELT）； 搜集到飞机残骸和碎片累计24047件，并设立残骸仓库，以便后续分类和分析。
经公安机关刑事技术部门工作，共确认120人身份，其中乘客114名，机组人员6人；理化实验室累计受理了66份检材，完成检验41份，均未检出常见无机炸药的主要离子成分，也未检出常见有机炸药成分。
截至26日12点，当地累计接待80名失联人员来梧家属共计493人，555人次，涉及17个省，74户家庭，累计安排家属478人到现场凭吊。上门安抚家属3800人次，开展心理评估747人次，开展心理辅导1182人次。
发布会介绍，因核心区附近地层受到较大冲击加之降水影响，边坡区域地质灾害风险较高，需要进一步制定精细化的开挖方案，应急指挥部在保证必要人力投入的同时也加大了技术投入。
1、搜集到飞机残骸和碎片累计24047件，并设立残骸仓库
发布会上，民航局安全检察专员、防控安全办公室主任朱涛表示，今天是事故发生的第六天，搜寻工作仍在进行中。截止3月26日12点，应急处置指挥部累计出动搜救人员10723人次，尚未发现幸存者和第二个黑匣子，搜寻到飞机残骸和碎片累计24047件，并设立残骸仓库，以便后续分类和分析。目前，搜救工作面临较大难度，因核心区附近地层受到较大冲击加之降水影响，边坡区域地质灾害风险较高，需要进一步制定精细化的开挖方案，应急指挥部努力克服困难，在保证必要人力投入的同时也加大了技术投入。
一方面通过无人机扫描、雷达等技术手段为搜救提供支持，对核心区进行精细化重点挖掘和残骸识别，另一方面协调组织专业力量，对核心外围和飞机坠落路线沿途大范围开展拉网式搜寻。
2、搜寻到与第二个黑匣子安装位置较近的一部紧急定位发射仪（ELT）
朱涛介绍，目前已搜寻到与第二个黑匣子安装位置较近的一部紧急定位发射仪（ELT）。
在家属救援善后工作方面，按照一人一专班的原则，继续做好家属的安抚、心理辅导和遗骸遗物认领工作，及时处理家属诉求。
截至26日12点，累计接待80名失联人员来梧家属共计493人，555人次，涉及17个省，74户家庭，累计安排家属478人到现场凭吊。上门安抚家属3800人次，开展心理评估747人次，开展心理辅导1182人次。在开展搜寻工作的同时，疫情防控工作也毫不放松，应急指挥部协调加强了现场消杀和现场人员防护用具的配备，同时严格落实每天一检的疫情防控流程，自3月25日15点—26日10点，在事故应急处置工作区域共设置核酸检测点31个，核酸检测2534人次。
3、完成检验的检材均未检出常见炸药成分
广西壮族自治区消防救援总队长郑西介绍，一方面，根据指挥部的指令，我们与交通运输、自然资源部门派到现场的大型机械作业队伍协同作战，搜集飞机残骸、遗骸、遗物和各类物证资料。同时，对前期搜寻过的事故核心区域、山头、丛林多次反复筛查，展开拉网式多层次的搜索。另一方面，根据事故现场直线距离约15公里的四旺村发现坠落飞机残骸的情况，我们派出了4个外围搜索组携带无人机、4G单兵图传、卫星电话等装备，以核心区为起点，通过搭乘摩托车、徒步行进等方式进入了7个沿线村屯的周边区域，以无人机超视距飞行侦查、红外热成像搜索、信息测绘标注、重点区域超低空核查和精细化建模等方式，沿客机飞行航线途径的约750亩面积区域开展了搜索工作。
目前，我们首批到场的消防救援力量已经连续工作了6天，参与队伍各级指挥员身先士卒，始终在一线组织开展救援工作，全体消防救援人员搜集范围累计超过24万平方米，搜集到部分遗体残骸和机体残骸，抽排积水1500立方，搭建洗消区，为现场作业人员完成洗消6000余次，开挖排水沟渠90米。
考虑到连日降雨，气温骤降骤升，烈日暴晒等因素的增加，对现场救援人员体力消耗的影响，为了保持队伍的战斗力，昨天晚上广西消防救援总队又下达命令，从贵港、来宾、贺州三个支队新调集了300名消防救援人员增援一线，今天中午第二批消防救援力量全部抵达藤县，已完成了任务交接，投入到搜救工作当中。
近日来，公安机关刑事技术部门出动220人，组成了29个勘察组，开展现场勘察、搜救和检验工作，共确认120人身份，其中乘客114名，机组人员6人，相关工作还在继续进行。理化实验室累计受理了66份检材，完成检验41份，均没有检出常见无机炸药的主要离子成分，也没有检出常见有机炸药成分。
4、民政部门对接收的遇难者遗骸、物品均已妥善保管
广西壮族自治区消防救援总队长郑西介绍，自治区民政厅殡葬服务人员已到场协助开展工作，民政部门对接收的遇难者遗骸、物品均已妥善保管。自然资源部门完成了对搜救区及其附近一带68平方公里的地质灾害风险情况调查评估，继续开展现场核心区雷达探测工作，探测面积约1500平方，共有7条坡面，探测结果已提交指挥部。追加搜救区及其附近一带的短临精细物地质灾害气象风险预警预报5次，地质灾害应急监测设备安装布点踏勘，搜寻核心区三维影像图及1：500的地形图，配合开挖方案，对开挖两侧的斜坡稳定性进行评价，为开挖方案提供参考依据。
卫生健康部门制订了加强和规范事故核心区消毒工作的方案，对核心区工作人员提出了明确要求，包括进出人员的规定，防护和现场作业人员的应急处置，严格规定消毒剂使用方法，规定核心区消毒措施和步骤，对指挥部莫埌村点，办公场所、医疗点、卫生间、广场、临时垃圾堆放点以及核心区外围的工作区、修整区、家属祭拜区等临时场所进行全面彻底的消毒，消毒面积累计3500平方米。
核心区洗消池已加放消毒剂，并对离开核心区的人员开展洗消工作。
5、东航成立专班对9名失联机组人员家属开展安抚工作
发布会上，东航集团宣传部部长刘晓东刘晓东表示：此次事故中我们有9位飞行、乘务和空保的同事失联，这几天来许多同事通过不同的方式表达了对机组人员的哀思，对家属的慰问。事件发生后，东航云南有限公司第一时间成立了专班，对9名失联机组的家属开展了安抚工作，派员进行陪护和心理疏导，公司管理人员多次上门进行慰问，帮助家属解决实际困难和生活问题，开展善后事宜。
同时，社会各界也给予了许多关心和帮助，我本人也曾经在云南公司工作过，此时此刻我想所有东航人的心情和我是一样的，都会与机组人员和家属站在一起，渡过最艰难的时刻。
6、现场有一定浓度的可燃气体，处于安全范围内
发布会上，广西壮族自治区消防救援总队后勤装备处副处长包庆斌表示，3月21日，接到救援指令后，救援总队紧急调集抢先救援车、化学洗消车等特种车辆164辆，抢险救援器材保障物资等2万余件套参与搜救工作。
在救援初期，采用空地联合，在空中使用无人机挂载热成像模块对事故区域进行快速搜索和航拍建模，为科学划分搜索区域提供依据。在地面，使用雷达生命探测仪，手持式红外热成像仪，通过微功率超宽带雷达、红外辐射探测技术进行生命迹象搜寻。
我们调派了消防救援人员搜救工作，在陡峭山坡区域运用绳索缓降、八爪鱼系统等系统辅助开展作业。我们发现主撞机点有航空燃油、液压油渗透土层，现场有一定浓度的可燃气体。
为此，我们使用六合一复合气体探测仪对核心区进行气体浓度监测，防止因可燃、有毒气体泄露引发次生灾害。目前，核心区气体监测数值均处于安全范围以内。
为解决因降雨导致的事故核心区积水问题，我们调派了10台次手抬机动泵进行抽水作业，累计抽排核心区积水1500立方米，保障了核心区搜救作业的正常进行。针对事故现场道路狭窄，路面泥泞，大型消防车辆难以行进这一问题，应急管理部消防救援局和广西消防救援总队调派多功能保障车和3辆全地型车，开展物证转移工作。
随着救援工作推进，我们根据救援现场环境变化，不断升级防疫洗消等级，调集了防化洗消车、洗消账篷、洗消药剂、洗消泵、喷雾机等车辆装备，在任务区设立三级洗消站，累计洗消6000余人次，6000余件套装备。
7.核心区西侧约12公里发现一块飞机残片
发布会披露，调查人员24日在勘验此前在水田中发现的飞机残片时，有邻村村民反映在自家的果园中发现了另一块疑似残片。调查人员在位于核心区西侧约12公里的藤县藤州镇礼秀村鸡头山果园发现一块长约8厘米、宽约3厘米的长方形复合材料残片，该残片位于水田中发现的残片北侧约2.3公里。初步判断该残片是水田中发现的弧形残片的一部分。
8、来梧需持48小时内核酸检测阴性证明
广西壮族自治区梧州市副市长苏颖在发布会上表示：事故发生以来，我们坚持人民至上，生命至上，统筹抓好疫情防控和事故应急处置工作。始终坚持既严格又体现人文关怀的疫情防控措施，目前全市疫情防控形势总体平稳有序。
一是及时出台疫情防控相关指导性文件，事故应急处置指挥部组织专家制定了《关于加强新冠肺炎疫情防控工作的指导意见》、《关于飞行事故现场作业人员疫情防控方案》、《飞行事故应急处置指挥部人员核酸检测方案》等五个文件，抓实抓细各项疫情防控工作。
二是守好入口关。加强入梧通道的管理服务，在机场、火车站、高速路口、动车站、口岸码头等设置便民核酸采样点，落实排查管理措施，查验健康码、行程码、核酸检测阴性证明，严守空中、陆路、水路三路防线。
三是落实人、物、环境同防，人员方面，我们在每一个定点接待酒店都设置了一个疫情防控指导组，由疾控、卫生监督等专业人员指导酒店开展疫情防控工作，确保定点接待酒店做好三码联查、提问监测等工作，为来梧支援、现场搜救、旅客家属、接待酒店工作人员等11类人员提供每日核酸检测服务。
3月21日以来，累计检测17373人次，其中旅客家属991人次，目前结果均为阴性。事故处置期间，对所有工作人员在严格落实健康监测的基础上，实施住宿点、工作地的相对封闭、闭环管理。酒店方面，在各接待酒店等设置了便民核酸检测点31个，对重点场所开展预防性消毒，累计消毒面积42万平方米，事故现场设立4个简易洗消站点，累计进行现场消杀面积达到3.87万平方米。
当前疫情防控形势严峻，自21日以来，事故应急处置有来自近20个省市的各方人员陆续抵梧，人员数量大，流动性强，给疫情防控工作带来很大的挑战。在此，我们请广大市民朋友继续做好戴口罩、保持社交距离等个人防护和健康监测，减少流动和聚集，积极配合开展核酸检测，落实疫情防控的要求。同时，呼吁关心此次事故的社会各界人士通过新闻了解关注，非必要不要来梧州。
根据当前疫情防控形势，对于来梧人员我们建议：
来梧前，一是中高风险地区被判定为密接者、次密接者、黄码、红码人员等暂缓来梧；二是来梧需持48小时内核酸检测阴性证明，同时健康码为绿码，行程码无显示中高风险区旅居史；三是按照疫情防控的有关事项，落实每天监测自身健康状况的要求。
到梧后，需健康申报，出示广西健康码、行程码，48小时内核酸检测阴性证明等，配合属地做好疫情防控的分类健康管理和相对闭环管理，并做好核酸检测、体温监测等疫情防控措施。
离梧前，在48小时内进行一次核酸检测，自离开梧州到抵达目的地期间，加强疫情防控的个人防护，继续遵循疫情防控关于卫生和社交距离的规定和要求。具体疫情防控的要求，可咨询梧州市疾控中心，咨询电话0774-3863725。
一杯黑茶的价值究竟有多大？
筑梦茶乡 福地湄潭 湄江印象一生一世只为一杯好茶
湄江印象 好茶 好印象 百年品质如一
一、什 么 是 黑 茶
黑茶是六大基本茶类之一，属于后发酵茶，主要产品以茯砖、黑砖、花砖、青砖、黔尖等产品为主，在古代，一部分内销山西、陕西、甘肃、绥远、宁夏、新疆、西藏、蒙古等地，一部分加工制压成砖，除内销西北各地外，还外销苏俄，特称“砖茶”。
二、 黑 茶，茶 中 “ 粗 粮 ”
第一，粗老叶富含木质纤维和茶多糖，这种木质纤维可增加肠胃蠕动、修复肠道功能。
另外，粗老叶茶多糖的含量是嫩叶的5至10倍。据科学测定，茶多糖含量以黑茶最高，活性最强。
茶多糖对降低血糖有显著功效，它可保护和刺激胰岛素细胞的分泌活动，从而起到降血糖的作用。
长期饮用黑茶对人体的血脂、血糖、血压具有良好的调节作用，并对体重、体形具有良好的调控作用。
第二，粗老叶含有丰富的茶色素。黑茶汤色的主要成分是茶黄素和茶红素。
研究表明，茶黄素是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，有美容、抗癌、抗突变、抑菌杀毒等功效。
其最大功效在于阻止血浆脂质的形成，延缓心脑血管血栓的形成。
第三，蛋白质、特种氨基酸丰富，茶叶中含有20%至30%的叶蛋白。
黑茶在渥堆发酵与存放过程中形成大量的Y-氨基丁酸，它能改善大脑血液循环，增加氧气供给，改善大脑细胞功能。
具有显著的降血压效果，对改善更年期综合征很有帮助。
黑茶中特有的茶氨酸还能起到抑制血压升高的作用。
三、金 花 “ 绽 放 ”，茶 中 “灵 芝 ”
黑茶经高温蒸压后，茶叶内部保存了一定的温湿度，在储存时内含物质得以继续转化。
滋味变醇，汤色加深，陈香显露，因而越陈越香，有的还可见到漂亮的“金花”。
这是一种有益的菌类，又称冠突散囊菌，它能分泌淀粉酶和氧化酶。
可催化茶叶中的淀粉转化为单糖，催化多酚类化合物氧化，为黑茶中的“上品”。
除了黑茶，在自然界中只有在千年灵芝中曾发现过它。
“金花”茶的品质好，因为冠突散囊菌在茶的后发酵过程中起到了辅助、催化作用。
其参与氧化、聚合、降解，转化了茶中的相关物质。
将茶叶中的淀粉转化为单糖，催化多酚类化合物氧化，从而使得茶汤回甜生津，醇厚鲜爽。
四、 黑 茶 的 市 场 价 值
目前国际前沿的茶叶研究倾向于茶叶的功能性方面，就此黑茶具有以下三方面功能：
第一营养功能——完整工艺的黑茶含有大量茶多糖、茶色素、特种氨基酸、多种微量元素钾、硒、锗等，对人体营养和微量元素补充具有积极意义。
第二感官功能——黑茶在后发酵的过程中，因为有益生菌的参与，茶多糖变为茶单糖，大分子的物质变成对人体有益的小分子物质。因此，越陈的黑茶汤色越红亮、口感越细滑、香味更显醇厚。
第三特殊功能——边疆牧民曾用“宁可三日无粮，不可一日无茶”形容安化黑茶，黑茶可“清热解毒”、“解酒醒酒”、“消宿食、消积食”、“消腥肉之食、解青稞之热”、“利二便，通大小肠”，黑茶无愧“功能性茶品”之称。
另外，黑茶的独特工艺技术被列入“非物质文化遗产”，是其独特价值的重要组成部分，黑茶三大类：“三尖”、“花卷”、“三砖”，其中千两茶需历经采茶、杀青、初揉、渥堆、拣茶、复揉、烘焙（松明柴火）、踩踏、制成等９步骤２３道工艺成型，且其工艺为手工完成。
从趋势上看黑茶对市场而言依然是一种比较稀缺的茶品，增值空间很大，对收藏品尤其如此。品种纯正、种植环境特殊、工艺复杂独特是黑茶价值得到市场认同的重要原因，走精品化、功能性茶饮的路线是安化黑茶的强盛之路。
五、 黑 茶 的 收 藏 价 值
黑茶消费者中存在着庞大的“存茶群体”，为什么呢？因为黑茶存在着“越陈越香”的特质，越陈越香就是黑茶陈化过程的形象化描述。
陈化过程是后发酵类型茶的独特现象，意指茶经过时间变化产生的品质变化，是黑茶价值提升的过程，专家发现陈化对黑茶起到三大作用：
Ａ、陈化是工艺的要求，将后发酵过程完成。体现在茯茶就是“金花”越多越值钱。
Ｂ、陈化是黑茶品质的提升再造。后发酵过程中微生物对差业内物质进行降解多种茶皂甙、γ–氨基丁酸等成分出现或含量提升。体现为喝黑茶不影响睡眠。
Ｃ、陈化过程中黑茶的香气出现有续变化。随着发酵度不同黑茶的香味有序变化，松香为、木香味、果香味等。发酵度达到１００％呈现无味之香，就是黑茶陈化达到顶点。
黑茶的保健功能跟其陈化过程密切相关，一般而言陈化度越高其保健功效随之提升。这一点是黑茶收藏价格步步提升的科学依据，也符合一般收藏家希望藏品随着时间延长其价值和附加价值提升的要求。
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一、什 么 是 黑 茶
黑茶是六大基本茶类之一，属于后发酵茶，主要产品以茯砖、黑砖、花砖、青砖、黔尖等产品为主，在古代，一部分内销山西、陕西、甘肃、绥远、宁夏、新疆、西藏、蒙古等地，一部分加工制压成砖，除内销西北各地外，还外销苏俄，特称“砖茶”。
二、 黑 茶，茶 中 “ 粗 粮 ”
第一，粗老叶富含木质纤维和茶多糖，这种木质纤维可增加肠胃蠕动、修复肠道功能。
另外，粗老叶茶多糖的含量是嫩叶的5至10倍。据科学测定，茶多糖含量以黑茶最高，活性最强。
茶多糖对降低血糖有显著功效，它可保护和刺激胰岛素细胞的分泌活动，从而起到降血糖的作用。
长期饮用黑茶对人体的血脂、血糖、血压具有良好的调节作用，并对体重、体形具有良好的调控作用。
第二，粗老叶含有丰富的茶色素。黑茶汤色的主要成分是茶黄素和茶红素。
研究表明，茶黄素是一种有效的自由基清除剂和抗氧化剂，有美容、抗癌、抗突变、抑菌杀毒等功效。
其最大功效在于阻止血浆脂质的形成，延缓心脑血管血栓的形成。
第三，蛋白质、特种氨基酸丰富，茶叶中含有20%至30%的叶蛋白。
黑茶在渥堆发酵与存放过程中形成大量的Y-氨基丁酸，它能改善大脑血液循环，增加氧气供给，改善大脑细胞功能。
具有显著的降血压效果，对改善更年期综合征很有帮助。
黑茶中特有的茶氨酸还能起到抑制血压升高的作用。
三、金 花 “ 绽 放 ”，茶 中 “灵 芝 ”
黑茶经高温蒸压后，茶叶内部保存了一定的温湿度，在储存时内含物质得以继续转化。
滋味变醇，汤色加深，陈香显露，因而越陈越香，有的还可见到漂亮的“金花”。
这是一种有益的菌类，又称冠突散囊菌，它能分泌淀粉酶和氧化酶。
可催化茶叶中的淀粉转化为单糖，催化多酚类化合物氧化，为黑茶中的“上品”。
除了黑茶，在自然界中只有在千年灵芝中曾发现过它。
“金花”茶的品质好，因为冠突散囊菌在茶的后发酵过程中起到了辅助、催化作用。
其参与氧化、聚合、降解，转化了茶中的相关物质。
将茶叶中的淀粉转化为单糖，催化多酚类化合物氧化，从而使得茶汤回甜生津，醇厚鲜爽。
四、 黑 茶 的 市 场 价 值
目前国际前沿的茶叶研究倾向于茶叶的功能性方面，就此黑茶具有以下三方面功能：
第一营养功能——完整工艺的黑茶含有大量茶多糖、茶色素、特种氨基酸、多种微量元素钾、硒、锗等，对人体营养和微量元素补充具有积极意义。
第二感官功能——黑茶在后发酵的过程中，因为有益生菌的参与，茶多糖变为茶单糖，大分子的物质变成对人体有益的小分子物质。因此，越陈的黑茶汤色越红亮、口感越细滑、香味更显醇厚。
第三特殊功能——边疆牧民曾用“宁可三日无粮，不可一日无茶”形容安化黑茶，黑茶可“清热解毒”、“解酒醒酒”、“消宿食、消积食”、“消腥肉之食、解青稞之热”、“利二便，通大小肠”，黑茶无愧“功能性茶品”之称。
另外，黑茶的独特工艺技术被列入“非物质文化遗产”，是其独特价值的重要组成部分，黑茶三大类：“三尖”、“花卷”、“三砖”，其中千两茶需历经采茶、杀青、初揉、渥堆、拣茶、复揉、烘焙（松明柴火）、踩踏、制成等９步骤２３道工艺成型，且其工艺为手工完成。
从趋势上看黑茶对市场而言依然是一种比较稀缺的茶品，增值空间很大，对收藏品尤其如此。品种纯正、种植环境特殊、工艺复杂独特是黑茶价值得到市场认同的重要原因，走精品化、功能性茶饮的路线是安化黑茶的强盛之路。
五、 黑 茶 的 收 藏 价 值
黑茶消费者中存在着庞大的“存茶群体”，为什么呢？因为黑茶存在着“越陈越香”的特质，越陈越香就是黑茶陈化过程的形象化描述。
陈化过程是后发酵类型茶的独特现象，意指茶经过时间变化产生的品质变化，是黑茶价值提升的过程，专家发现陈化对黑茶起到三大作用：
Ａ、陈化是工艺的要求，将后发酵过程完成。体现在茯茶就是“金花”越多越值钱。
Ｂ、陈化是黑茶品质的提升再造。后发酵过程中微生物对差业内物质进行降解多种茶皂甙、γ–氨基丁酸等成分出现或含量提升。体现为喝黑茶不影响睡眠。
Ｃ、陈化过程中黑茶的香气出现有续变化。随着发酵度不同黑茶的香味有序变化，松香为、木香味、果香味等。发酵度达到１００％呈现无味之香，就是黑茶陈化达到顶点。
黑茶的保健功能跟其陈化过程密切相关，一般而言陈化度越高其保健功效随之提升。这一点是黑茶收藏价格步步提升的科学依据，也符合一般收藏家希望藏品随着时间延长其价值和附加价值提升的要求。
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客户文献分享| IF=14.612，基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反应癌症免疫疗
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
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期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
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