5月最全新能源车型销量榜单之：纯电车型销量排行榜TOP 90
写在前面的话：
1、6月17日得到乘联会口径的车型销售数据榜单，6月18日将新能源榜单整理发布，其中对于当月没有销售的车型，不计入榜单。部分车型在统计口径方面未结合纯电与插混车型（主要是比亚迪），因此，将未拆分车型全部计入插混车型（虽然数据略有偏差，但不影响总体排名）；
2、针对特斯拉的数据进行拆分，将出口数据扣除；对比亚迪汉车型拆分为EV销量与DM销量，其余车型不涉及大幅度的数据调整，故未进行验证。
3、对于榜单的点评区按照榜单分别进行。
4、概括总结：新能源乘用车总体产销两旺，已经有新势力品牌进入纯电TOP10榜单中，传统主机厂依旧全面落后；比亚迪有4款车型进入插混TOP10榜单，可以说“全面霸榜”也毫不夸张，因为比亚迪1家的混动销量占据5月混动总销量的40%。
纯电车型榜单：
1、本次入榜车型113款，比上月的125款少12款，其中91款有真实销售，22款本月没有产生销售。其中包括比亚迪的E1、E3、宋pro新能源、秦pro新能源（这两款车预计是给马上就要上市的DMi车型让位吧）；高尔夫纯电（ID3申报就是替换高尔夫纯电动版的）；捷豹E-PACE继4月销售挂零之后，5月继续挂零。年度销售停留在695辆；上汽荣威的Marvel X本月销量挂零，其替代车型R品牌的Marvel R 本月销量440台，除了小车CLEVER，上汽乘用车依旧没有找到自己的纯电拳头产品在哪里；广汽与蔚来的合作车型，合创HYCAN 007本月销量为零，年度累积销量为28辆。不出意外的话，这个合作很难继续下去了；上月挂零的日产轩逸纯电版，本月销量10台，日产在纯电方面的不作为也似乎成了日系车企的代表了。
2、 我们来看看有关华为概念纯电车的代表——北汽极狐的销量：极狐ARCFOX αS 5月销量231辆，环比增长3750%（4月销售6辆），今年累积销量246辆。极狐ARCFOX αT 5月销量123辆，环比增长38.5%，今年累积销量521辆；极狐几乎都把把所以的赌注都压在华为身上，接下来就看看这款车真正进入交付期的销量到底如何吧。
3、如果以月销1000辆为标尺做一个划分，在91款车型中，仅仅只有31款达到这个标准，其余60款车型均未能实现月销1000辆，其中，更是有20款车型未达到月销100辆的成绩。月销在两位数的不乏合资知名品牌，奥迪e-tron（主要是因为e-tron要国产导致）、现代三款纯电车型、日产轩逸纯电、丰田C-HR 纯电、别克微蓝7以及广汽埃安Aion LX。这些曾经全球知名的合资品牌在进入纯电阶段也全面面临着水土不服的状态。
4、TOP 10纯电车型4月销量84986辆，占总销量的59.12％，比4月的53.3%提高了近6个百分点；TOP 20纯电车型4月销量109590辆，占总销量的76.23％，比4月的73.5%提高了近3个百分点（相当于仅计算11-20名，销量占比还下降了）；TOP 30纯电车型4月销量123796辆，占总销量的86.11％，比4月的84.4%提高了近2个百分点。可以说随着市场的发展，反而产品销量集中度在提高，一方面说明头部产品销量持续走高，另一方面说明TOP20以后企业的销售堪忧。
5、5月纯电榜单中，新势力的纯电总体表演优异，小鹏P7和哪吒V两款车型进入TOP10榜单了，这也是哪吒第二次进入TOP10榜单，是小鹏P7第一次进入TOP10榜单，可以说小鹏P7磷酸铁锂版还是受到市场欢迎的（市场目前有P7低价流入网约车的传言）。小鹏的G3、蔚来的ES6、EC6、威马的EX5、零跑T03以及广汽埃安新车Aion Y也首次进入到TOP20行列。随着合众汽车的两款哪吒车型销量的增长，合众也暂时取代理想成为造车新势力中销量排名第三的选手，努力挤入新势力的第一梯队，而威马汽车仅仅依靠EX5在苦苦支撑，新车W6 5月销售706辆，EX6仅销售2辆，开始略显乏力了，无论是上市还是新车，有点逐渐从新势力第一梯队滑落的意思了。目前，国产新势力造车的格局总体没有实质变化，第一梯队：新势力三兄弟蔚、小、理；第二梯队：合众（有冲击第一梯队的巨大潜力）、零跑、威马、爱驰；第三梯队：赛力斯、北汽极狐；合创算是基本上很难了，预备部队没有揭开盖子的就剩下恒驰了。
6、特斯拉总是需要单独说一说的，5月乘联会给出的Model 3 销量为20735辆，这个销量是包含出口11527辆的，实际国内销量在9208辆。4月在突然经历国内销量大幅下降之后，Model 3的销量也未能恢复到去年同期1万辆的水平，Model Y也取代3成为特斯拉的主销车型，并且预计会很快发布磷酸铁锂版Y，继续把价格下探到28万左右。“上海车展”事件带来的风波尚未最终散去，用铁锂版Model Y来弥补Model 3销量下滑的"大坑"，总体来说特斯拉在中国的销量也许会大概率保持在2-2.5万辆左右一段时间。
7、重点说一下A00级产品的的情况，在TOP10榜单里，A00级车型有4款车型，合计销量45176辆，5月全部A00级纯电车型销量为49942辆，占全部纯电车型销量的30.84%。可以说2021年1-5月纯电市场的增长主要是依靠A00级车型拉动的。如果扣除A00级车型的销售，则新能源的渗透率仅仅只有8.95%，其中纯电车型6.9%，我们在欢呼5月纯电渗透率超过11%的时候，也要要正视A0级以上的纯电车型渗透率仅仅只有6.9%的事实，而其余3%的渗透率则都是由A00级车贡献的事实。这也算是在热市场的冷思考吧（后续会有专门一篇专栏进行分析）。
8、继续说说传统主机厂的纯电表现，自主品牌新能源的主力选手略有变化，五菱、比亚迪、长安、广汽埃安、奇瑞新能源保持不变，长城欧拉则由于芯片原因导致全品牌月度销量仅仅只有3597辆。宏光MINI EV销量2.6万辆，依然是销量榜第一，但5月销量环比下降8.58%，这已经是MINI EV连续两个月的下滑了。不知道MINI EV的这波全网营销之后，能不能恢复到月销3万以上的节奏；在进入TOP20榜单的车型中，比亚迪依旧有三款车型，广汽埃安有两款车型、长安（A00级）、奇瑞（A00级）、上汽乘用车（A00级）各有一款。长安、奇瑞、上汽乘用车、吉利这几家自主品牌燃油车销量的巨头，在面对新能源潮流时，表现的有点水土不服。于是，吉利的新能源之路只好依托推“极氪”这个有点“模仿”新势力的全新品牌，长安则寄希望于和华为、宁德成立的全新合资公司“阿维塔”；奇瑞则转型混动车型，上汽乘用车则推出了与阿里合作的“智己”L7，长城则更为极端一点，沙龙品牌直接发力氢燃料汽车。仿佛只有比亚迪一家，按照自己既定的新能源路线，踏实、稳健的走下去。
9、传统合资品牌在纯电车上的表现，依旧可以用“无存在感”来形容。排名最高的是大众的ID4 X（32名）和宝马的iX3（35名），他们5月销量仅仅只有847和817辆，依旧没有达到1000辆以上。BBA三家中，只有宝马的纯电销量还能一看，奔驰EQC 424辆，奥迪e-tron干脆在等国产，奥迪家还有一个Q2L e-tron销量493，环比4月下降42.94%。基本上可以这么说，BBA的这一代纯电车型与同级别国产新势力车型相比，无论是产品力还是软件能力存在明显的“代差”。其余的合资品牌就更不值得一提了，只有广汽丰田的“套壳车”iA5进入了TOP50的行列，其余都是在50名开外。
10、最后还是说说日系与韩系吧（其实没啥可说），日、韩系车企在这一波新能源的浪潮中，似乎点错了科技树，就像老王在亚布力说的“战略选择错误，浪费的不只是金钱，更多的是时间与时机”。怎么办呢？我们只能一起看着点错科技树的演变与结局吧（就像看游戏直播一样）。
写在前面的话：
1、6月17日得到乘联会口径的车型销售数据榜单，6月18日将新能源榜单整理发布，其中对于当月没有销售的车型，不计入榜单。部分车型在统计口径方面未结合纯电与插混车型（主要是比亚迪），因此，将未拆分车型全部计入插混车型（虽然数据略有偏差，但不影响总体排名）；
2、针对特斯拉的数据进行拆分，将出口数据扣除；对比亚迪汉车型拆分为EV销量与DM销量，其余车型不涉及大幅度的数据调整，故未进行验证。
3、对于榜单的点评区按照榜单分别进行。
4、概括总结：新能源乘用车总体产销两旺，已经有新势力品牌进入纯电TOP10榜单中，传统主机厂依旧全面落后；比亚迪有4款车型进入插混TOP10榜单，可以说“全面霸榜”也毫不夸张，因为比亚迪1家的混动销量占据5月混动总销量的40%。
纯电车型榜单：
1、本次入榜车型113款，比上月的125款少12款，其中91款有真实销售，22款本月没有产生销售。其中包括比亚迪的E1、E3、宋pro新能源、秦pro新能源（这两款车预计是给马上就要上市的DMi车型让位吧）；高尔夫纯电（ID3申报就是替换高尔夫纯电动版的）；捷豹E-PACE继4月销售挂零之后，5月继续挂零。年度销售停留在695辆；上汽荣威的Marvel X本月销量挂零，其替代车型R品牌的Marvel R 本月销量440台，除了小车CLEVER，上汽乘用车依旧没有找到自己的纯电拳头产品在哪里；广汽与蔚来的合作车型，合创HYCAN 007本月销量为零，年度累积销量为28辆。不出意外的话，这个合作很难继续下去了；上月挂零的日产轩逸纯电版，本月销量10台，日产在纯电方面的不作为也似乎成了日系车企的代表了。
2、 我们来看看有关华为概念纯电车的代表——北汽极狐的销量：极狐ARCFOX αS 5月销量231辆，环比增长3750%（4月销售6辆），今年累积销量246辆。极狐ARCFOX αT 5月销量123辆，环比增长38.5%，今年累积销量521辆；极狐几乎都把把所以的赌注都压在华为身上，接下来就看看这款车真正进入交付期的销量到底如何吧。
3、如果以月销1000辆为标尺做一个划分，在91款车型中，仅仅只有31款达到这个标准，其余60款车型均未能实现月销1000辆，其中，更是有20款车型未达到月销100辆的成绩。月销在两位数的不乏合资知名品牌，奥迪e-tron（主要是因为e-tron要国产导致）、现代三款纯电车型、日产轩逸纯电、丰田C-HR 纯电、别克微蓝7以及广汽埃安Aion LX。这些曾经全球知名的合资品牌在进入纯电阶段也全面面临着水土不服的状态。
4、TOP 10纯电车型4月销量84986辆，占总销量的59.12％，比4月的53.3%提高了近6个百分点；TOP 20纯电车型4月销量109590辆，占总销量的76.23％，比4月的73.5%提高了近3个百分点（相当于仅计算11-20名，销量占比还下降了）；TOP 30纯电车型4月销量123796辆，占总销量的86.11％，比4月的84.4%提高了近2个百分点。可以说随着市场的发展，反而产品销量集中度在提高，一方面说明头部产品销量持续走高，另一方面说明TOP20以后企业的销售堪忧。
5、5月纯电榜单中，新势力的纯电总体表演优异，小鹏P7和哪吒V两款车型进入TOP10榜单了，这也是哪吒第二次进入TOP10榜单，是小鹏P7第一次进入TOP10榜单，可以说小鹏P7磷酸铁锂版还是受到市场欢迎的（市场目前有P7低价流入网约车的传言）。小鹏的G3、蔚来的ES6、EC6、威马的EX5、零跑T03以及广汽埃安新车Aion Y也首次进入到TOP20行列。随着合众汽车的两款哪吒车型销量的增长，合众也暂时取代理想成为造车新势力中销量排名第三的选手，努力挤入新势力的第一梯队，而威马汽车仅仅依靠EX5在苦苦支撑，新车W6 5月销售706辆，EX6仅销售2辆，开始略显乏力了，无论是上市还是新车，有点逐渐从新势力第一梯队滑落的意思了。目前，国产新势力造车的格局总体没有实质变化，第一梯队：新势力三兄弟蔚、小、理；第二梯队：合众（有冲击第一梯队的巨大潜力）、零跑、威马、爱驰；第三梯队：赛力斯、北汽极狐；合创算是基本上很难了，预备部队没有揭开盖子的就剩下恒驰了。
6、特斯拉总是需要单独说一说的，5月乘联会给出的Model 3 销量为20735辆，这个销量是包含出口11527辆的，实际国内销量在9208辆。4月在突然经历国内销量大幅下降之后，Model 3的销量也未能恢复到去年同期1万辆的水平，Model Y也取代3成为特斯拉的主销车型，并且预计会很快发布磷酸铁锂版Y，继续把价格下探到28万左右。“上海车展”事件带来的风波尚未最终散去，用铁锂版Model Y来弥补Model 3销量下滑的"大坑"，总体来说特斯拉在中国的销量也许会大概率保持在2-2.5万辆左右一段时间。
7、重点说一下A00级产品的的情况，在TOP10榜单里，A00级车型有4款车型，合计销量45176辆，5月全部A00级纯电车型销量为49942辆，占全部纯电车型销量的30.84%。可以说2021年1-5月纯电市场的增长主要是依靠A00级车型拉动的。如果扣除A00级车型的销售，则新能源的渗透率仅仅只有8.95%，其中纯电车型6.9%，我们在欢呼5月纯电渗透率超过11%的时候，也要要正视A0级以上的纯电车型渗透率仅仅只有6.9%的事实，而其余3%的渗透率则都是由A00级车贡献的事实。这也算是在热市场的冷思考吧（后续会有专门一篇专栏进行分析）。
8、继续说说传统主机厂的纯电表现，自主品牌新能源的主力选手略有变化，五菱、比亚迪、长安、广汽埃安、奇瑞新能源保持不变，长城欧拉则由于芯片原因导致全品牌月度销量仅仅只有3597辆。宏光MINI EV销量2.6万辆，依然是销量榜第一，但5月销量环比下降8.58%，这已经是MINI EV连续两个月的下滑了。不知道MINI EV的这波全网营销之后，能不能恢复到月销3万以上的节奏；在进入TOP20榜单的车型中，比亚迪依旧有三款车型，广汽埃安有两款车型、长安（A00级）、奇瑞（A00级）、上汽乘用车（A00级）各有一款。长安、奇瑞、上汽乘用车、吉利这几家自主品牌燃油车销量的巨头，在面对新能源潮流时，表现的有点水土不服。于是，吉利的新能源之路只好依托推“极氪”这个有点“模仿”新势力的全新品牌，长安则寄希望于和华为、宁德成立的全新合资公司“阿维塔”；奇瑞则转型混动车型，上汽乘用车则推出了与阿里合作的“智己”L7，长城则更为极端一点，沙龙品牌直接发力氢燃料汽车。仿佛只有比亚迪一家，按照自己既定的新能源路线，踏实、稳健的走下去。
9、传统合资品牌在纯电车上的表现，依旧可以用“无存在感”来形容。排名最高的是大众的ID4 X（32名）和宝马的iX3（35名），他们5月销量仅仅只有847和817辆，依旧没有达到1000辆以上。BBA三家中，只有宝马的纯电销量还能一看，奔驰EQC 424辆，奥迪e-tron干脆在等国产，奥迪家还有一个Q2L e-tron销量493，环比4月下降42.94%。基本上可以这么说，BBA的这一代纯电车型与同级别国产新势力车型相比，无论是产品力还是软件能力存在明显的“代差”。其余的合资品牌就更不值得一提了，只有广汽丰田的“套壳车”iA5进入了TOP50的行列，其余都是在50名开外。
10、最后还是说说日系与韩系吧（其实没啥可说），日、韩系车企在这一波新能源的浪潮中，似乎点错了科技树，就像老王在亚布力说的“战略选择错误，浪费的不只是金钱，更多的是时间与时机”。怎么办呢？我们只能一起看着点错科技树的演变与结局吧（就像看游戏直播一样）。
客户文献分享| IF=14.612，基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反应癌症免疫疗
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
了解金开瑞iTRAQ定量蛋白质组学技术：https://t.cn/A6V4xP7Y
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
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【造车新势力4月销量出炉：销量增长成常态，蔚来、小鹏最有看头】五一黄金周刚开始，大家仍在放假休息，但部分造车新势力却在“加班加点”发布4月销量成绩单。目前，蔚来、理想、小鹏、哪吒、零跑汽车已经发布了4月的销量数据，同比增长幅度颇有看点，我们一起来看看。蔚来汽车依然强势，并预测了Q2交付量其中，蔚来汽车无论是4月销量，还是今年1-4月累计销量，都稳居第一。4月销量为7,102辆，同比增长125.1%；1-4月累计销量达27,162辆，可谓成绩表现出色。4月份，全新蔚来ES8交付1,523辆，蔚来ES6交付3,163辆，蔚来EC6交付2,416辆。此外，蔚来汽车也发布了一季度的财报。蔚来一季度营收79.8亿元，同比劲增481.8%，且现金储备超过475亿元，整车毛利率更是显著增长，达到了21.2%。细究其因，一方面是因为销量的增长，一定程度地提升了营收额；另一方面随着产能的提升以及生产能力、规模的成熟与壮大，同样一定程度提升营收额与毛利率。在今年4月7日，蔚来就已经迎来第10万辆量产车下线，不到一年的时间蔚来量产车从5万辆翻倍至10万辆，可见其发展之迅速。目前获悉，蔚来预估了第二季度的交付量或将达到21,000-22,000辆，但目前最大的困难在于芯片的短缺。所以说，这时很考验蔚来汽车的应对能力，不过在蔚来的发展史中，有过比这更艰难的日子，相信蔚来也能从容度过这次挑战。理想汽车仅靠一款车走天下4月的造车新势力销量数据中，排在第二的是理想汽车。理想汽车在4月交付了5,539辆，同比增长111.3%，且截至4月底，理想汽车累计新车交付量已经达到51,715辆，创下了造车新势力中最快交付5万辆的纪录。要知道的是，理想汽车目前仅有理想ONE一款车型。能够有这般成绩，足以说明了这款车型的实力，也足以印证了理想汽车的韧性。不过，理想汽车第二款量产车也很快就要到来了，据悉将于2022年推出。目前获悉这款车型定位于大型6座SUV，基于LRM2.0的平台打造，价格区间或在35-50万元之间，直接对标奔驰GLS。想要获得一只票的最大涨幅，当然是要从底部开始布局的，但是很多股友难以把握买卖点，其实很时候炒股是需要借力的。俗话说得好“山不向我走来，我便向他走去”。4月布局基本都是3月就开始的，这几天刚好到了5月布局的时间，我花了一周的时间，找到了一组潜力极强的好票，由于平台审核，这里不便公布，还是老样子 ,▶▶▶获取方式▶▶▶（公众号）+〔股 事 捉 妖〕——回复:~五月~即可！筛选条件如下：1）最新价较4月以来最低价涨幅不足20%；2）评级机构10家以上且最新市值200亿元以上；3）一季报净利增长且今明两年预测净利增速均超过20%；4）按照今年一致预测净利计算最新市盈率在30倍以下同时，新款理想ONE也有望在年内亮相，相比之下新车在外观、内饰方面有小调整，且增强了配置。如此一来，理想ONE便更具竞争实力了。小鹏汽车未来的市场最值得期待紧跟随后的是小鹏汽车，4月交付量为5,147辆，同比增长285%，实现连续10个月同比翻番。因此，小鹏汽车的飞速发展是有目共睹的。虽然其4月的销量比理想汽车的交付量略少，但小鹏汽车今年1-4月18,487的累计销量，却比理想汽车略胜一筹，实现同比增长413%。这个增长幅度非常夸张，但却意味着小鹏汽车今年开局走势不错，值得我们期待。况且，小鹏汽车也目前是最有看头、最有热点的造车新势力。为什么这么说？因为在上海车展，小鹏汽车旗下第三款车型小鹏P5可谓万众瞩目，毕竟它的标签是“全球首款搭载激光雷达的量产智能汽车”，加之在车展开启预订后，仅53小时其订单便突破10,000辆。故而，小鹏P5或将有望成为小鹏汽车的增量车型。据悉这款车将在今年第四季度开始交付，倘若开启交付后仍能保持这番热度，那么2021年就是小鹏汽车的爆发之年了，这一点确实值得我们期待。哪吒汽车、零跑汽车4月销量同比暴涨除了这几大造车新势力之外，哪吒汽车和零跑汽车的成绩也值得赞叹。其中，哪吒汽车4月销量为4,015辆，同比增长高达532%；1-4月累计销量达11,458辆，同比增长432%。无论是当月销量的增长幅度，还是1-4月销量的增长幅度，都相当惊人。但背后所透露的信息便是，哪吒汽车今年同样迎来了爆发。值得注意的是，在上海车展刚刚上市的哪吒U PRO目前订单已突破5,000辆，可预见哪吒汽车的销量仍会继续上涨。从目前的产品矩阵来看，哪吒汽车有哪吒N01、哪吒U、哪吒V，主打的车型为紧凑型SUV哪吒U。但随着SUV矩阵的完善，比如小型SUV哪吒V的“辅助”，哪吒汽车的销量趋势正稳步上行，待其轿车车型哪吒S上市后，或许还会吸引更多的消费者，打造更具魅力的品牌实力。而零跑汽车则在4月交付2770辆，但同比增长幅度相当夸张，同比增长幅度达到了866%，且环比增长278%。目前，零跑汽车2021款零跑T03在上海车展已正式上市，搭载了LEAP PILOT 2.0智能驾驶系统，并拥有15个高精传感器、10项智能驾驶辅助功能，可以说智能科技全新升级，有望继续引领A00级纯电市场。而且，中型SUV零跑C11的出现，也将会一定程度地提升零跑汽车的销量以及名气。就数据分析来看，零跑汽车销量增长的趋势相比之下虽偏向稳当，但很有可能在未来迎来爆发的转折点。汽车网评：造车新势力百花齐放，创造新局势从目前的局势分析，造车新势力4月销量集体爆发，同比增幅颇大，第一梯度的造车新势力仍占据主导地位。其中，蔚来销量、产能，甚至是营收额、毛利率都有不错的数据表现。芯片则成为蔚来目前向上发展的唯一障碍。而理想汽车的阵容矩阵虽看似“可怜”，却毫无逊色之意。此外，小鹏汽车今年迎来爆发，不仅如此，小鹏汽车还站在“风口浪尖”上，带来了搭载激光雷达的小鹏P5，其未来的市场看点十足。然而，哪吒汽车、零跑汽车紧跟身后，但丝毫没有“认输”的态势。相反，随着产品矩阵的完善，哪吒汽车与零跑汽车也有望在未来持续带来惊喜。当然了，目前如威马、爱驰、云度等造车新势力的销量仍未更新，同样值得我们关注。诚然，造车新势力在今年可谓百花齐放，全新的局势已然到来，我们不得不重新审视这些造车新势力的实力，以及它们对行业的影响了。 #汽车板块全线回调长安汽车大跌# #股票# #蔚来遭香橼做空单日成交额创记录#
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