【郭台铭喊话蔡英文直接授权买疫苗 蔡愿面谈】鸿海创办人郭台铭积极申请采购500万剂BNT疫苗赴台，至今发展不明。郭台铭于当地时间18日早在脸书（Facebook）发表八点声明，并提出希望能会见蔡英文。郭台铭强调，在此事上绝无任何政治和商业企图，未来可受外界检验，最后为苍生请命，并向蔡英文喊话，没有您的明确裁示、疫苗的采购永远不能真正的开始。
郭台铭盼会见蔡英文吁政府表达立场接受疫苗捐赠
台北中时电子报报道，郭台铭18日上午在脸书贴文向蔡英文报告，他表示在台湾疫苗短缺的关键时刻，对于蔡英文向媒体表示要开绿灯、协助永龄基金会向海外取得疫苗，感到又有了希望。
郭台铭说，因为忧心台湾疫情肆虐，人命关天，从5月23日起，就经由各种方式，希望与政府洽谈，突破限制，购买疫苗捐赠与政府；6月1日依主管机关要求送件后，迟迟未获得主管机关正式回复，6月10日行文给卫福部部长陈时中，2天后取得部分进展，“让我们有些许振奋”。
郭台铭指出，能在6月13日和主管机关开会，晚间又接获陈时中来电，表达会协助本案。可惜的是在端午连假结束后，又有消息传来民进党不同派系间有不同的意见，巧合的是又有媒体出现无法查证信息来源的不实报道，各种看不见的力量开始对此案产生技术性拖延。
郭台铭提出以下建议，首先，政府公开表示接受永龄基金会的捐赠，让这个捐赠的购买可以拥有代表政府的採购权（永龄可正式发中英文新闻稿，对外表示即日起可以用捐赠者的角色代表政府向疫苗原厂接洽）。郭台铭认为，既然都在国际上公开了，也不会担心假货的问题，开大门走大路，官民合作的关系需要正式授权，为国际洽商营造有利的条件。
其次郭台铭建议“同意我方提出的捐赠合约，进入实质细节的讨论，也同意我方对于采购德国BNT（上海复星制药代理），由德国制造出货的疫苗，所提出的合约架构图，并给予相应于合约的进口许可相关法律文件”。
郭台铭说，疫苗捐赠因为标的物涉及相关法律责任，和一般物品的捐赠不同，需要政府（受赠方）先明确表达立场，再让愿意捐赠方去洽谈疫苗供货的数量及时间。
郭台铭表示，目前国际上认证的疫苗虽是卖方市场，但若蔡英文和台湾人民愿意让他有个机会，用他数十年的国际人脉与商业经验为大家服务，应该能有所突破。对政府来说，这是新增一个可能的管道，并不排挤原有的疫苗採购，就算永龄最后没有成功，对政府也没有任何损失，希望蔡英文能接受建言。
郭台铭强调，在此事上绝无任何政治和商业企图，未来可受外界检验，最后为苍生请命，希望能会见蔡英文。
“总统府”表态称蔡英文乐意与郭董会面将安排
香港中评社报道，对于郭台铭18日早上在脸书上的声明“总统府”发言人张惇涵表示，对于郭董事长提案洽购疫苗之事务，近期各界有许多不实传闻，或许导致郭董事长有所误解。但我们期待，郭董事长不要受到未经证实的传闻所影响。
张惇涵说，蔡英文始终乐意与郭董事长见面会谈，对于郭的提议，也会进行后续安排。
他表示，政府的立场不变，也正尽力促成这项计划。我们期盼，政府与民间通力合作，为台湾取得更多疫苗供应，让合法、安全、有效的疫苗有更充裕的供应来源，确保民众健康安全。
对此，负责执行采购任务的永龄基金会执行长刘宥彤18日上午出面受访时表示，若蔡英文有意和郭台铭见面，就尽快敲定时间，今天下午也可以，郭台铭随时准备好与蔡英文见面。
郭台铭指买疫苗绿派系有意见 江启臣：总统应说明
另据中央社报道，此外，针对郭台铭表示，在洽谈疫苗过程中，民进党派系间有不同意见。国民党主席江启臣表示，感谢郭台铭在这段时间为民众争取疫苗的努力，国民党自始至终就呼吁政府应“开大门、纳善意”，让所有民间力量包括企业与团体，能够帮人民争取有效安全且国际认证的疫苗，但听到郭台铭这两天的声明，让人感到非常难过。
江启臣还表示，民间这么努力，郭台铭只是要帮民众尽份力量，让大家有好的疫苗可施打，但民进党派系还要介入，这攸关人命，蔡英文应出面说清楚。
谈到能够如何协助郭台铭，江启臣表示，国民党已成立疫苗对策委员会，现在疫苗采购，岛内有好几个民间力量努力，包括郭台铭、工商团体，只要洽谈过程，国民党能帮忙协助的，一定会尽全力协助沟通。他呼吁政府采购疫苗数量要多，种类也要多，让民众有所选择。#侨报新闻速递# https://t.cn/A6fPFeDy
郭台铭盼会见蔡英文吁政府表达立场接受疫苗捐赠
台北中时电子报报道，郭台铭18日上午在脸书贴文向蔡英文报告，他表示在台湾疫苗短缺的关键时刻，对于蔡英文向媒体表示要开绿灯、协助永龄基金会向海外取得疫苗，感到又有了希望。
郭台铭说，因为忧心台湾疫情肆虐，人命关天，从5月23日起，就经由各种方式，希望与政府洽谈，突破限制，购买疫苗捐赠与政府；6月1日依主管机关要求送件后，迟迟未获得主管机关正式回复，6月10日行文给卫福部部长陈时中，2天后取得部分进展，“让我们有些许振奋”。
郭台铭指出，能在6月13日和主管机关开会，晚间又接获陈时中来电，表达会协助本案。可惜的是在端午连假结束后，又有消息传来民进党不同派系间有不同的意见，巧合的是又有媒体出现无法查证信息来源的不实报道，各种看不见的力量开始对此案产生技术性拖延。
郭台铭提出以下建议，首先，政府公开表示接受永龄基金会的捐赠，让这个捐赠的购买可以拥有代表政府的採购权（永龄可正式发中英文新闻稿，对外表示即日起可以用捐赠者的角色代表政府向疫苗原厂接洽）。郭台铭认为，既然都在国际上公开了，也不会担心假货的问题，开大门走大路，官民合作的关系需要正式授权，为国际洽商营造有利的条件。
其次郭台铭建议“同意我方提出的捐赠合约，进入实质细节的讨论，也同意我方对于采购德国BNT（上海复星制药代理），由德国制造出货的疫苗，所提出的合约架构图，并给予相应于合约的进口许可相关法律文件”。
郭台铭说，疫苗捐赠因为标的物涉及相关法律责任，和一般物品的捐赠不同，需要政府（受赠方）先明确表达立场，再让愿意捐赠方去洽谈疫苗供货的数量及时间。
郭台铭表示，目前国际上认证的疫苗虽是卖方市场，但若蔡英文和台湾人民愿意让他有个机会，用他数十年的国际人脉与商业经验为大家服务，应该能有所突破。对政府来说，这是新增一个可能的管道，并不排挤原有的疫苗採购，就算永龄最后没有成功，对政府也没有任何损失，希望蔡英文能接受建言。
郭台铭强调，在此事上绝无任何政治和商业企图，未来可受外界检验，最后为苍生请命，希望能会见蔡英文。
“总统府”表态称蔡英文乐意与郭董会面将安排
香港中评社报道，对于郭台铭18日早上在脸书上的声明“总统府”发言人张惇涵表示，对于郭董事长提案洽购疫苗之事务，近期各界有许多不实传闻，或许导致郭董事长有所误解。但我们期待，郭董事长不要受到未经证实的传闻所影响。
张惇涵说，蔡英文始终乐意与郭董事长见面会谈，对于郭的提议，也会进行后续安排。
他表示，政府的立场不变，也正尽力促成这项计划。我们期盼，政府与民间通力合作，为台湾取得更多疫苗供应，让合法、安全、有效的疫苗有更充裕的供应来源，确保民众健康安全。
对此，负责执行采购任务的永龄基金会执行长刘宥彤18日上午出面受访时表示，若蔡英文有意和郭台铭见面，就尽快敲定时间，今天下午也可以，郭台铭随时准备好与蔡英文见面。
郭台铭指买疫苗绿派系有意见 江启臣：总统应说明
另据中央社报道，此外，针对郭台铭表示，在洽谈疫苗过程中，民进党派系间有不同意见。国民党主席江启臣表示，感谢郭台铭在这段时间为民众争取疫苗的努力，国民党自始至终就呼吁政府应“开大门、纳善意”，让所有民间力量包括企业与团体，能够帮人民争取有效安全且国际认证的疫苗，但听到郭台铭这两天的声明，让人感到非常难过。
江启臣还表示，民间这么努力，郭台铭只是要帮民众尽份力量，让大家有好的疫苗可施打，但民进党派系还要介入，这攸关人命，蔡英文应出面说清楚。
谈到能够如何协助郭台铭，江启臣表示，国民党已成立疫苗对策委员会，现在疫苗采购，岛内有好几个民间力量努力，包括郭台铭、工商团体，只要洽谈过程，国民党能帮忙协助的，一定会尽全力协助沟通。他呼吁政府采购疫苗数量要多，种类也要多，让民众有所选择。#侨报新闻速递# https://t.cn/A6fPFeDy
客户文献分享| IF=14.612，基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反应癌症免疫疗
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
了解金开瑞iTRAQ定量蛋白质组学技术：https://t.cn/A6V4xP7Y
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
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【山东消协发布2020年山东消费者投诉十大热点事件】2020年，山东省消费者协会组织全年共受理消费者投诉39678件，处结率100%，为消费者挽回经济损失1600余万元。2020年，全省消协组织受理消费者投诉呈现以下热点：
预付式消费。投诉反映较为集中的领域为健身、美容美发、餐饮、教育培训等。投诉反映的主要问题：一是承诺不兑现，办卡容易退卡难，发卡企业诱导消费者预存充值，未履行事先约定提供商品或服务，又拒绝给消费者退钱或扣除消费者高额违约金。二是经营者利用不公平格式条款，多方限制消费者的权利，减轻、逃避自身责任。三是经营场所发生关门、歇业、易主、变更经营场所时，债权债务不做妥善处理就自行终止服务，对消费者的合理诉求置之不理。四是部分商家涉嫌诈骗，以办卡优惠条件为诱饵诈骗钱财，一旦得手就卷款走人，给消费者维权造成很大困难。
教育培训。投诉反映的主要问题：一是因为疫情原因，很多培训机构没有开课，线下培训改为线上，师资不到位、授课效果打折扣或者开课之后未按照约定进行正常上课，有的直接关门跑路等，消费者退款困难。二是虚假或者夸大宣传，随意编造教师资历和经验，夸大办学能力和授课老师的教学水平名不符实，教学质量与承诺不符，上课质量达不到标准、课程效果不尽人意等。三是一旦交费，退费很难。消费者因个人原因要求退费时，培训机构拒绝退款、拖延退款或要求消费者承担高额违约金。四是合同中存在“霸王条款”或者随意变更合同，未经消费者同意随意更改课时、合并班级甚至取消课程。五是很多培训机构存在乱收费现象，不给消费者开具发票和提供有效凭证，或者不与消费者签合同、协议，消费者维权时难以提供有效证据。
防疫用品。受新冠肺炎疫情影响，食品及医疗用品、消毒用品投诉上升幅度较大，涉及价格、质量问题的居多，主要是因短时期内交通及供应不及时，一些商家囤积居奇、哄抬物价，特别是医用口罩、消毒液、酒精用量剧增，一时紧俏，一些不良商家假冒正规厂家产品、以次充好等。
家用电子电器。投诉反映的主要问题：一是商家促销活动频繁且力度较大，部分商场货源组织不充足导致送货不及时。二是售后服务不到位。尤其是在夏季空调、电扇等纳凉类家电的销售和使用增多，出现了送货安装不及时、维修不及时等问题。三是在网店购买的小家电问题较多，增加了消费者退换货的费用。
家用汽车。投诉反映的主要问题：一是产品质量问题多。投诉大部分反映在汽车零部件上，如发动机、变速箱等主要部件屡现故障。二是购车合同争议大。经营者签订合同多为格式条款，明显倾向于经营者，排除消费者主要权利。三是售后服务问题。故障不能一次性修好，出现返修状况，或故障多次维修却不能彻底解除，维修不出具明细等。四是捆绑销售车险和诱导消费者贷款,搭售价外增值服务，如金融服务费、上牌费等各种费用。五是二手车消费信息不实，经营者隐瞒实情销售。六是“交车不交证”，不能保障随车证件的完整交付,如车辆合格证延后交付，影响上牌和行驶。
服装鞋帽。投诉反映的主要问题：一是个别经营者在商品出现质量问题时，不履行“三包”义务，拒绝退换货、补偿等。二是服装投诉主要集中在做工粗糙、服装标识不全。三是个别经营者销售假冒、套牌的服装鞋帽或者销售“三无”产品等。
通信终端。投诉发映的主要问题：一是过度维修、维修价格不透明、后续质保无保障等；二是智能手机存在“间歇性”质量问题，但经销商演示时问题显示不出来；三是手机配件质量无标准、以次充好、强制更换等时有发生，维修水平有待提高；四是手机维修不彻底，存在重复维修现象，指定维修点较少；五是鉴定机构少，自己鉴定生产的产品，既当“裁判员”，又当“运动员”，结论缺乏公信力，动辄以消费者使用不当为由，拒绝承担相应的“三包”责任；六是修理者故意不给消费者维修工单，以逃脱维修两次后仍然不能正常使用而应承担的换货责任，消费者维权难以提供证据。
远程购物。随着新经济时代的来临，网络购物成为广大消费者的主要购物方式，网络纠纷也日趋增多。投诉反映的主要问题：一是网络宣传有虚假，部分网络商家存在“全网最低价”等违法广告用语，一些经营者修改实物图片，或者产品质量性能存在虚假宣传。二是销售商品质量难以保证，出现以次充好、以假充真的问题。个别网店还存在虚假认证、刷单炒信用和好评问题。三是商品售后服务难以保证，与实体店相比，网上销售的产品由于供货商并不明确，部分网络经营者所显示的售后服务承诺并不被厂家承认；有些打折产品，消费者下单付款后，商家称没有库存不予发货，承诺的优惠、赠品不兑现。四是网络经营主体信息不全，生产商、发货方、代理商等头绪多，消费者维权时，由于网络主体信息不全、不详或虚构地址信息、销售者注册地与经营地不一致等原因，造成查无实处，甚至无法取得联系，给相关部门处理消费纠纷带来困难，消费者难以有效维权。五是网购协议暗藏不公平格式条款。首次注册或软件更新后，都需要消费者同意经营者的协议，否则无法登录。消费者往往未加关注或不能完全理解协议的具体内容，导致后期维权陷入被动。六是个人信息泄露，商家促销短信不胜其烦。
家庭装修。投诉反映的主要问题：一是装修质量问题。如墙面开裂、水电管网布局不合理、防水不彻底、功能区预留空间不足等。二是虚假宣传问题，主要集中于实际使用的建材品牌和档次与宣传或样品不符，“全包”“一口价”“免费装修”多是营销噱头。三是合同约定不明确，后期增项收费较多。四是很多装修公司单独收取设计费，但设计师水平参差不齐，甚至用一张设计图复制给不同客户。五是全屋定制家具“不合身”。如，设计好看安装后却不实用，主材、辅料、配件等偷工减料或后期被迫加钱，安装粗放售后跟不上等。
网络游戏。疫情助力了网络游戏消费，特别是一些少年儿童迷恋网 络游戏，不惜高额充值消费，待家长发现时，往往时过境迁，欲追回费用却因异地并缺少经营主体信息等因素，存在一定困难。山东省消协就受理3起未成年网络游戏消费投诉，有的充值达7万余元。消费者投诉的主要问题：一是一些视频APP推出免费试用，试用期后默认自动续费，消费者在不知情的情况下被扣费。二是未成年人大额充值纠纷多，家长要求退款难。三是某些视频网站消费者购买会员后，观看热门影视剧仍需单独付费，引发不满。四是网络游戏经营者利用不公平条款，侵害消费者选择权、财产权，如在上线网络游戏产品的展示视频中加贴“最终效果以游戏内容为准”，使双方约定处于不确定状态，为自己违反约定开脱和免责。五是网络游戏道具抽奖概率不明，引发消费者群体投诉。
针对以上消费领域和投诉反映的主要问题，山东省消协提醒广大消费者：一要提升消费维权意识和自我保护能力，当自身合法权益受到侵害时，积极向有关部门或当地消协组织投诉，依法维权；二是在消费时要向经营者索要发票等有效凭证，一旦发生消费纠纷，便于维权；三要科学理性消费，尤其老年消费者，不要被商家名目繁多的所谓“优惠”促销活动迷惑，科学消费，理性消费。
山东省消协将联合各地消协组织有针对性地开展相关领域的消费教育、消费调查、消费体验、消费评议等活动，对投诉较多的经营者集中约谈，对严重侵害消费者合法权益的行为集中曝光，促进企业守法诚信经营，履行企业作为保护消费者合法权益第一责任人的责任。同时，积极配合有关部门开展相关领域的商品和服务监督检查活动，强化市场监管，促进行业自律，进一步净化消费市场环境。https://t.cn/A6tRTPnY
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教育培训。投诉反映的主要问题：一是因为疫情原因，很多培训机构没有开课，线下培训改为线上，师资不到位、授课效果打折扣或者开课之后未按照约定进行正常上课，有的直接关门跑路等，消费者退款困难。二是虚假或者夸大宣传，随意编造教师资历和经验，夸大办学能力和授课老师的教学水平名不符实，教学质量与承诺不符，上课质量达不到标准、课程效果不尽人意等。三是一旦交费，退费很难。消费者因个人原因要求退费时，培训机构拒绝退款、拖延退款或要求消费者承担高额违约金。四是合同中存在“霸王条款”或者随意变更合同，未经消费者同意随意更改课时、合并班级甚至取消课程。五是很多培训机构存在乱收费现象，不给消费者开具发票和提供有效凭证，或者不与消费者签合同、协议，消费者维权时难以提供有效证据。
防疫用品。受新冠肺炎疫情影响，食品及医疗用品、消毒用品投诉上升幅度较大，涉及价格、质量问题的居多，主要是因短时期内交通及供应不及时，一些商家囤积居奇、哄抬物价，特别是医用口罩、消毒液、酒精用量剧增，一时紧俏，一些不良商家假冒正规厂家产品、以次充好等。
家用电子电器。投诉反映的主要问题：一是商家促销活动频繁且力度较大，部分商场货源组织不充足导致送货不及时。二是售后服务不到位。尤其是在夏季空调、电扇等纳凉类家电的销售和使用增多，出现了送货安装不及时、维修不及时等问题。三是在网店购买的小家电问题较多，增加了消费者退换货的费用。
家用汽车。投诉反映的主要问题：一是产品质量问题多。投诉大部分反映在汽车零部件上，如发动机、变速箱等主要部件屡现故障。二是购车合同争议大。经营者签订合同多为格式条款，明显倾向于经营者，排除消费者主要权利。三是售后服务问题。故障不能一次性修好，出现返修状况，或故障多次维修却不能彻底解除，维修不出具明细等。四是捆绑销售车险和诱导消费者贷款,搭售价外增值服务，如金融服务费、上牌费等各种费用。五是二手车消费信息不实，经营者隐瞒实情销售。六是“交车不交证”，不能保障随车证件的完整交付,如车辆合格证延后交付，影响上牌和行驶。
服装鞋帽。投诉反映的主要问题：一是个别经营者在商品出现质量问题时，不履行“三包”义务，拒绝退换货、补偿等。二是服装投诉主要集中在做工粗糙、服装标识不全。三是个别经营者销售假冒、套牌的服装鞋帽或者销售“三无”产品等。
通信终端。投诉发映的主要问题：一是过度维修、维修价格不透明、后续质保无保障等；二是智能手机存在“间歇性”质量问题，但经销商演示时问题显示不出来；三是手机配件质量无标准、以次充好、强制更换等时有发生，维修水平有待提高；四是手机维修不彻底，存在重复维修现象，指定维修点较少；五是鉴定机构少，自己鉴定生产的产品，既当“裁判员”，又当“运动员”，结论缺乏公信力，动辄以消费者使用不当为由，拒绝承担相应的“三包”责任；六是修理者故意不给消费者维修工单，以逃脱维修两次后仍然不能正常使用而应承担的换货责任，消费者维权难以提供证据。
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网络游戏。疫情助力了网络游戏消费，特别是一些少年儿童迷恋网 络游戏，不惜高额充值消费，待家长发现时，往往时过境迁，欲追回费用却因异地并缺少经营主体信息等因素，存在一定困难。山东省消协就受理3起未成年网络游戏消费投诉，有的充值达7万余元。消费者投诉的主要问题：一是一些视频APP推出免费试用，试用期后默认自动续费，消费者在不知情的情况下被扣费。二是未成年人大额充值纠纷多，家长要求退款难。三是某些视频网站消费者购买会员后，观看热门影视剧仍需单独付费，引发不满。四是网络游戏经营者利用不公平条款，侵害消费者选择权、财产权，如在上线网络游戏产品的展示视频中加贴“最终效果以游戏内容为准”，使双方约定处于不确定状态，为自己违反约定开脱和免责。五是网络游戏道具抽奖概率不明，引发消费者群体投诉。
针对以上消费领域和投诉反映的主要问题，山东省消协提醒广大消费者：一要提升消费维权意识和自我保护能力，当自身合法权益受到侵害时，积极向有关部门或当地消协组织投诉，依法维权；二是在消费时要向经营者索要发票等有效凭证，一旦发生消费纠纷，便于维权；三要科学理性消费，尤其老年消费者，不要被商家名目繁多的所谓“优惠”促销活动迷惑，科学消费，理性消费。
山东省消协将联合各地消协组织有针对性地开展相关领域的消费教育、消费调查、消费体验、消费评议等活动，对投诉较多的经营者集中约谈，对严重侵害消费者合法权益的行为集中曝光，促进企业守法诚信经营，履行企业作为保护消费者合法权益第一责任人的责任。同时，积极配合有关部门开展相关领域的商品和服务监督检查活动，强化市场监管，促进行业自律，进一步净化消费市场环境。https://t.cn/A6tRTPnY
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