miRNA的表达载体构建

实验原理

miRNA是在真核生物中发现的具有调控功能的内源性非编码RNA，大小约20~25个核苷酸。我们根据成熟miRNA序列信息，合成含有茎环结构的前体miRNA连接至含侧翼序列的表达载体中(见图6.1），将其转染/病毒包装感染进入细胞后，由II型启动子（CMV）启动表达，经核酸酶的剪切加工，组装RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。

技术应用

通过过表达miRNA研究其功能并进行靶点筛选的后期研究工作

实验流程

【Science | microRNA靶向效率的生化基础】microRNA是来源于前体转录本的约22核苷酸的非编码RNA调控序列。每个miRNA都与一个Argonaute（AGO）蛋白形成一个沉默复合体，miRNA与靶标转录本配对随后AGO蛋白促进靶标变得不稳定或者是进行转录抑制。哺乳动物中最保守的90个miRNA家族有平均超过400个保守的靶标。miRNA结合靶点的效率对于理解miRNA的作用过程和作用机制大有裨益，但是对于miRNA-AGO复合物与靶标转录本之间结合亲和力的检测一直没有很好的方法。
近日，Whitehead研究所David P. Bartel研究组在Science发表文章，对RNA bind-n-seq（RBNS）测序进行优化，优化后的方法提供了AGO2对于其结合位点的相对强度的量化，而且没有差异交联效率的混淆效应，使得该方法能够用于测量miRNA-AGO复合体与所有小于12nt靶标结合的相对亲和力的大小。本研究建立了一种对miRNA-AGO复合体与靶点高通量相对结合亲和力检测的方式，建立了对于miRNA-靶点相互作用的网络，对于未来更好地了解和预测miRNA靶向功能提供了重要的生物化学基础。
https://t.cn/A6PXvIup

#遗传学研究#【《Nature Genetics---MiCEE是一种调节表观遗传沉默及核仁组织的ncRNA-蛋白复合体】
真核生物基因组的大部分被转录为非编码RNA（ncRNA），它们是通过控制染色质结构调节不同核过程的重要因子。然而，完整的ncRNA功能仍难以明确。在最新的研究中，研究人员破译了microRNA Mirlet7d作为双向转录基因的关键调控因子的功能。研究人员发现，核Mirlet7d绑定从这些基因表达的ncRNAs。Mirlet7d-ncRNA双链体进一步与C1D结合，后者又将RNA外泌体复合物与多梳抑制复合物2（PRC2）靶向双向活性的基因位点。外泌体降解ncRNA，而PRC2则通过EZH2诱导异染色质以及转录沉默。此外，这种首次被命名为MiCEE的多组分RNA-蛋白复合物将受调控的基因束缚在核周区域，因此需要适当的核仁组织。本研究表明，MiCEE复合体介导双向表达基因以及全基因组组织的表观遗传沉默。 原文链接：https://t.cn/RB6hOtP