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#如何用电转拯救我们难转染的细胞？
当我们做转染实验的时候，总会遇到一些难转染的细胞。恰巧课题组研究的是原代细胞、神经细胞或者是免疫细胞，化学转染方法反复试验失败，这时候就得借助电转来帮助我们推进实验进程了。
对于贴壁细胞和悬浮细胞，在电转前需要进行不同的处理。
贴壁细胞
电穿孔前一天，通过胰酶消化释放贴壁细胞，将细胞转移到含新鲜生长培养基的75cm2 细胞瓶中，接种密度应保证电穿孔当天细胞能够达到50%~70％的汇合度（多数细胞系为每次电穿孔1 X 105 ~ 10 X105细胞）。
实验当天，吸出生长培养基， PBS 洗涤细胞，胰酶消化释放贴壁细胞。取胰酶消化的细胞悬液，用血细胞计数板计数细胞密度。细胞悬液于室温下500g 离心5min 。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~ 5 X 106 细胞／mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
悬浮细胞
电穿孔前一天，于75cm2 细胞瓶中用新鲜生长培养基稀释细胞， 以保证电穿孔当天细胞能够达到指数生长中期的汇合度( 0. 5 X 106~4 X 106 个细胞／mL ) 。计数细胞并按上述离心收集细胞。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~5 X 106 个细胞／mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
电穿孔操作步骤
1. 在电穿孔仪器上设置参数。根据细胞类型选择预设程序或优化程序。对于指数程序（即指数衰减脉冲） ， 通常电容为1050μF , 电压在200 ~ 350V 。一般260V 起始电压、以50V递增对大多数细胞有效。内部阻抗设为无限大。
2.向电穿孔杯中加入10 ~ 50μg 质粒DNA 。如有必要， 可加入运载DNA，使DNA 总量达到120μg 。
3.向电穿孔杯中加入细胞，轻轻反复吹打使细胞和DNA 混匀。
4. 将电穿孔杯放进电穿孔仪，盖上盖子，进行一次电脉冲。
5. 立即向电穿孔杯中加入0.5mL 生长培养基，然后将电击后的细胞转移到合适大小的组织培养皿或多孔板中。如有必要， 用生长培养基漂洗0.2cm 或0.4cm 电穿孔杯，然后将漂洗液加到培养皿或培养板内的细胞中。
6.对每个样品和每个电压增量均重复步骤5 和步骤6 。记录每个电穿孔杯的实际脉冲时间和时间常数以便于各次实验间的比较。对于哺乳动物细胞，最适条件是场强为400 ~ 900V/cm、脉冲时间或时间常数为10 ~ 40ms 。轻轻晃动平板以使细胞均匀分布于整个孔或培养皿。
7.将培养皿或培养板放到含5 %~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养细胞6 ~ 24h 。
8.检测细胞活力。
9. 如要分离稳定转染体，可按分离步骤操作。
10.对于瞬时表达，于电穿孔后24 ~96h对细胞进行检测。
同时，电穿孔效率受以下几种因素的影响：
1.外加电场的强度。电压过低，培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过；电压过高，细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系， 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔， 20% ～ 50％的细胞能够存活（根据台盼蓝拒染法的检测结果）。
2.电脉冲时间的长短。通常对细胞进行单次电脉冲。电脉冲的持续时间、电场形状和强度由电源容量及电穿孔杯尺寸决定。多数电穿孔装置允许研究者控制脉冲参数，电穿孔仪有指数衰减波和方形波两种电脉冲形状可供选择。
3. 温度。有些研究者报道， 电穿孔过程中将细胞维持在室温时瞬时表达水平最高；而有的将细胞保持在0 °C 获得了更好的结果。造成以上差异的原因可能是细胞类型不同或电穿孔过程中产热量不同， 较高电压（大于1000V/cm)、较长时间电脉冲（大于l00ms) 的情况容易产生较多的热量。电脉冲处理后再将细胞于电穿孔室内孵育l ~2min 可提高瞬时表达效率 。
4.DNA 的构象与浓度。虽然线性和环状DNA 均能够通过电穿孔进行转染，但采用线性DNA 进行瞬时表达和稳定转化的水平均更高些 。采用1 ~40μg/mL 浓度的DNA 可获得高效的转染。质粒纯度也是影响电穿孔效率的重要因素。
5.培养基的离子成分。用缓冲盐溶液（如HEPES 盐缓冲液）悬浮细胞，转染效率比用含甘露糖或蔗糖等非离子物质的缓冲液高数倍。
6.细胞的生理状态。生长活跃、状态健康、无污染、最好低代次的细胞可获得最佳转染效果。
当我们做转染实验的时候，总会遇到一些难转染的细胞。恰巧课题组研究的是原代细胞、神经细胞或者是免疫细胞，化学转染方法反复试验失败，这时候就得借助电转来帮助我们推进实验进程了。
对于贴壁细胞和悬浮细胞，在电转前需要进行不同的处理。
贴壁细胞
电穿孔前一天，通过胰酶消化释放贴壁细胞，将细胞转移到含新鲜生长培养基的75cm2 细胞瓶中，接种密度应保证电穿孔当天细胞能够达到50%~70％的汇合度（多数细胞系为每次电穿孔1 X 105 ~ 10 X105细胞）。
实验当天，吸出生长培养基， PBS 洗涤细胞，胰酶消化释放贴壁细胞。取胰酶消化的细胞悬液，用血细胞计数板计数细胞密度。细胞悬液于室温下500g 离心5min 。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~ 5 X 106 细胞／mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
悬浮细胞
电穿孔前一天，于75cm2 细胞瓶中用新鲜生长培养基稀释细胞， 以保证电穿孔当天细胞能够达到指数生长中期的汇合度( 0. 5 X 106~4 X 106 个细胞／mL ) 。计数细胞并按上述离心收集细胞。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~5 X 106 个细胞／mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
电穿孔操作步骤
1. 在电穿孔仪器上设置参数。根据细胞类型选择预设程序或优化程序。对于指数程序（即指数衰减脉冲） ， 通常电容为1050μF , 电压在200 ~ 350V 。一般260V 起始电压、以50V递增对大多数细胞有效。内部阻抗设为无限大。
2.向电穿孔杯中加入10 ~ 50μg 质粒DNA 。如有必要， 可加入运载DNA，使DNA 总量达到120μg 。
3.向电穿孔杯中加入细胞，轻轻反复吹打使细胞和DNA 混匀。
4. 将电穿孔杯放进电穿孔仪，盖上盖子，进行一次电脉冲。
5. 立即向电穿孔杯中加入0.5mL 生长培养基，然后将电击后的细胞转移到合适大小的组织培养皿或多孔板中。如有必要， 用生长培养基漂洗0.2cm 或0.4cm 电穿孔杯，然后将漂洗液加到培养皿或培养板内的细胞中。
6.对每个样品和每个电压增量均重复步骤5 和步骤6 。记录每个电穿孔杯的实际脉冲时间和时间常数以便于各次实验间的比较。对于哺乳动物细胞，最适条件是场强为400 ~ 900V/cm、脉冲时间或时间常数为10 ~ 40ms 。轻轻晃动平板以使细胞均匀分布于整个孔或培养皿。
7.将培养皿或培养板放到含5 %~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养细胞6 ~ 24h 。
8.检测细胞活力。
9. 如要分离稳定转染体，可按分离步骤操作。
10.对于瞬时表达，于电穿孔后24 ~96h对细胞进行检测。
同时，电穿孔效率受以下几种因素的影响：
1.外加电场的强度。电压过低，培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过；电压过高，细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系， 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔， 20% ～ 50％的细胞能够存活（根据台盼蓝拒染法的检测结果）。
2.电脉冲时间的长短。通常对细胞进行单次电脉冲。电脉冲的持续时间、电场形状和强度由电源容量及电穿孔杯尺寸决定。多数电穿孔装置允许研究者控制脉冲参数，电穿孔仪有指数衰减波和方形波两种电脉冲形状可供选择。
3. 温度。有些研究者报道， 电穿孔过程中将细胞维持在室温时瞬时表达水平最高；而有的将细胞保持在0 °C 获得了更好的结果。造成以上差异的原因可能是细胞类型不同或电穿孔过程中产热量不同， 较高电压（大于1000V/cm)、较长时间电脉冲（大于l00ms) 的情况容易产生较多的热量。电脉冲处理后再将细胞于电穿孔室内孵育l ~2min 可提高瞬时表达效率 。
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