蛋白质印迹（Western blot）介绍
蛋白质印迹（或免疫印迹）分析程序可从复杂混合物（例如细胞或组织提取物）中鉴定和定量单个蛋白质。 通常，该技术涉及在变性条件下通过凝胶电泳分离蛋白质，从凝胶上将蛋白质电泳转移或“印迹”到固体支持膜，用对目标蛋白质具有特异性的抗体探测该膜，然后观察结合的抗体 使用标记的第二免疫试剂。 因此，蛋白质印迹技术是在不同条件下对健康和疾病中的组织或培养细胞进行蛋白质组学分析的必不可少的检测方法。
W B实验步骤:
一、样品的裂解
◇制备出细胞培养物的裂解物
1.将细胞培养皿置于冰上，用低温的PBS对细胞进行洗涤。
2.吸出PBS缓冲液后再加入介于0℃的细胞裂解缓冲液（每107细胞/100mm；培养皿/150cm2 培养瓶中加入1ml；每5×106 细胞/60mm培养皿/75cm2 培养瓶中加入0.5ml）。
3.用预冷后的细胞刮棒将贴壁细胞刮下，然后将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中后；
4.在4℃温度条件下下持续搅拌约30分钟左右；
5.在4℃预冷后的离心机中以16000×g的转速离心大约20分钟左右；
6.小心地将离心管从离心机中取出，防止在冰上，然后将上清液转移到放置冰上的新离心管中后，弃去沉淀。
◇制备组织裂解物
1.在0℃条件下，用干净的工具切取目标组织（注意：该过程需要快速完成），以确保样品不会被蛋白酶降解；
2.将组织置于圆底的微量离心管中，然后浸入液氮中进行速冻，将样品保存在-80℃下以备后续试验继续使用，也可放置冰块上直接进行匀浆。取约5mg的组织，然后向离心管中快速加入约300μL的裂解缓冲液，选用电动匀浆器进行匀浆，另外的300μL裂解缓冲液冲对刀片进行两次清洗，然后在4℃下持续搅拌（一般实验选用回旋振荡器上）2小时。
3.4℃温度条件下，在微型离心机中以16000×g的离心速度离心约20分钟，然后轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰块上。将上清液转移放置在冰上的新离心管中后弃去沉淀物。
二、样品制备
1.取约50μL的裂解物，进行蛋白分析，以确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
2.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2×Laemmli样品缓冲液。一般推荐采用以下方法对样品进行还原和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
3.还原和变性：在100℃温度条件下，将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5分钟左右，之后进行分装。在-20°C温度下保存裂解物，注意：分装细胞裂解物(50-100μL)，避免反复冻融循环。
4.在37℃温度条件下，对装有细胞裂解为的离心管进行解冻，在微量离心机中以16,000×g的离心率，离心约5分钟。
三、上样和电泳
1.将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
2.在100V下电泳1至2小时。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。
凝胶百分比取决于蛋白质的大小：
4～40kDa 12～45kDa 10～70kDa 15～100kDa 25～200kDa
20% 15%12.5%10%8%
四、把蛋白质从凝胶转移到膜
膜可以是硝酸纤维素或PVDF，两者各具优点。用甲醇活化PVDF约1分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液对PVDF进行冲洗。实验过程中需要对时间和电压进行优化（依据设备）。在封闭步骤之前采用丽春红染色法检查转膜，所得膜可用于抗体染色。
五、抗体的染色
1.用5%封闭溶液在室温条件下封闭膜约1小时，或在4℃条件下封闭约24小时；
2.用适当稀释度的一抗在5%或2%封闭溶液中4℃约12小时孵育膜，或在室温条件下孵育约2小时；
3.用TBST洗涤膜3次，每次大约5分钟；
4.用推荐稀释度的标记二抗，在含5%封闭缓冲液的TBST中室温条件下孵育膜1小时；
5.使用TBST缓冲液冲洗膜3次，每次大约5分钟，然后用TBS缓冲液进行冲洗；
6.要产生信号，请遵循试剂盒厂商的实验方法；
7.去除多余的试剂，并采用透明塑料膜覆盖膜；
8.利用暗室显影技术，采集化学发光图像，也可以利用常规图像扫描法采集比色检测的图像。
蛋白质印迹（或免疫印迹）分析程序可从复杂混合物（例如细胞或组织提取物）中鉴定和定量单个蛋白质。 通常，该技术涉及在变性条件下通过凝胶电泳分离蛋白质，从凝胶上将蛋白质电泳转移或“印迹”到固体支持膜，用对目标蛋白质具有特异性的抗体探测该膜，然后观察结合的抗体 使用标记的第二免疫试剂。 因此，蛋白质印迹技术是在不同条件下对健康和疾病中的组织或培养细胞进行蛋白质组学分析的必不可少的检测方法。
W B实验步骤:
一、样品的裂解
◇制备出细胞培养物的裂解物
1.将细胞培养皿置于冰上，用低温的PBS对细胞进行洗涤。
2.吸出PBS缓冲液后再加入介于0℃的细胞裂解缓冲液（每107细胞/100mm；培养皿/150cm2 培养瓶中加入1ml；每5×106 细胞/60mm培养皿/75cm2 培养瓶中加入0.5ml）。
3.用预冷后的细胞刮棒将贴壁细胞刮下，然后将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中后；
4.在4℃温度条件下下持续搅拌约30分钟左右；
5.在4℃预冷后的离心机中以16000×g的转速离心大约20分钟左右；
6.小心地将离心管从离心机中取出，防止在冰上，然后将上清液转移到放置冰上的新离心管中后，弃去沉淀。
◇制备组织裂解物
1.在0℃条件下，用干净的工具切取目标组织（注意：该过程需要快速完成），以确保样品不会被蛋白酶降解；
2.将组织置于圆底的微量离心管中，然后浸入液氮中进行速冻，将样品保存在-80℃下以备后续试验继续使用，也可放置冰块上直接进行匀浆。取约5mg的组织，然后向离心管中快速加入约300μL的裂解缓冲液，选用电动匀浆器进行匀浆，另外的300μL裂解缓冲液冲对刀片进行两次清洗，然后在4℃下持续搅拌（一般实验选用回旋振荡器上）2小时。
3.4℃温度条件下，在微型离心机中以16000×g的离心速度离心约20分钟，然后轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰块上。将上清液转移放置在冰上的新离心管中后弃去沉淀物。
二、样品制备
1.取约50μL的裂解物，进行蛋白分析，以确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
2.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2×Laemmli样品缓冲液。一般推荐采用以下方法对样品进行还原和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
3.还原和变性：在100℃温度条件下，将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5分钟左右，之后进行分装。在-20°C温度下保存裂解物，注意：分装细胞裂解物(50-100μL)，避免反复冻融循环。
4.在37℃温度条件下，对装有细胞裂解为的离心管进行解冻，在微量离心机中以16,000×g的离心率，离心约5分钟。
三、上样和电泳
1.将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
2.在100V下电泳1至2小时。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。
凝胶百分比取决于蛋白质的大小：
4～40kDa 12～45kDa 10～70kDa 15～100kDa 25～200kDa
20% 15%12.5%10%8%
四、把蛋白质从凝胶转移到膜
膜可以是硝酸纤维素或PVDF，两者各具优点。用甲醇活化PVDF约1分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液对PVDF进行冲洗。实验过程中需要对时间和电压进行优化（依据设备）。在封闭步骤之前采用丽春红染色法检查转膜，所得膜可用于抗体染色。
五、抗体的染色
1.用5%封闭溶液在室温条件下封闭膜约1小时，或在4℃条件下封闭约24小时；
2.用适当稀释度的一抗在5%或2%封闭溶液中4℃约12小时孵育膜，或在室温条件下孵育约2小时；
3.用TBST洗涤膜3次，每次大约5分钟；
4.用推荐稀释度的标记二抗，在含5%封闭缓冲液的TBST中室温条件下孵育膜1小时；
5.使用TBST缓冲液冲洗膜3次，每次大约5分钟，然后用TBS缓冲液进行冲洗；
6.要产生信号，请遵循试剂盒厂商的实验方法；
7.去除多余的试剂，并采用透明塑料膜覆盖膜；
8.利用暗室显影技术，采集化学发光图像，也可以利用常规图像扫描法采集比色检测的图像。
【给迷你脑戴上迷你帽，拯救实验动物的工程壮举】#约翰霍普金斯大学#科研团队近期开发出了可能是世界上最小的#脑电图#电极帽，可用来测量圆点大小的微型#大脑#的相关活动，为大脑相关的研究提供了一个重要工具。
脑类器官也称为“迷你大脑”，是实验室培养的人脑细胞球，它模仿了大脑的一些结构和功能。一直以来，为这些微型器官创造微型仪器都是一大挑战。传统的类器官检测仪器是平的，研究人员只能检测其表面的有限细胞。而该团队开发的微型脑电图帽则包裹在类器官的整个球形表面，使整个表面的3D记录成为可能，从而更好地捕捉神经元细胞之间的相互交流。
采用传统方法测试一种化学物质需要大约1000只老鼠，成本约为100万美元。采用该技术或可大大减少测试化学效应所需的动物数量；此外来自类器官的结果也更相关，因为人类大脑与老鼠的大脑非常不同。
图1：培养皿中的脑类器官；图2：大脑类器官（绿色）被封装在蓝色外壳电极装置中。详情参考：https://t.cn/A6SMpVWD 英文：https://t.cn/A6SMpVWd
脑类器官也称为“迷你大脑”，是实验室培养的人脑细胞球，它模仿了大脑的一些结构和功能。一直以来，为这些微型器官创造微型仪器都是一大挑战。传统的类器官检测仪器是平的，研究人员只能检测其表面的有限细胞。而该团队开发的微型脑电图帽则包裹在类器官的整个球形表面，使整个表面的3D记录成为可能，从而更好地捕捉神经元细胞之间的相互交流。
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ibidi活细胞培养系统成功安装调试
广州科适特科学仪器有限公司给深圳科研单位在奥林巴斯IX73显微镜上加装活细胞培养装置，运行稳定，效果良好。
ibidi活细胞工作站，是专为活细胞成像观察设计的。该系统适用于所有的倒置显微镜，可为活细胞成像提精确稳定的温度、CO2/O2和湿度条件，避免样品在培养箱和显微镜之间来回移动对实验结果造成的不利影响。
产品特点：
适合于所有的显微镜平台----适合各种具框架或者96孔板卡槽的倒置显微镜；
为样品提供理想的照明---由于具加热盖所以没有冷凝现象，有吸引力的的样品稳定性，适合于DIC；
活细胞观察应用的理想设计---显微镜下的孵育条件。
1.顶部加热，避免冷凝现象，细胞生长更好
2.可长时间稳定活细胞培养
3.价格经济实惠
4.组装方便，规格多样化
ibidi镜载微型培养箱，专为活细胞成像设计，光路上无遮挡，不会影响采集图片质量，特殊的热盖设计，培养皿盖无冷凝水，给成像一个无干扰的清晰视野。稳定的温度，可控的湿度和CO2浓度，都为活细胞成像提供了必要条件。
使用简便
操作简单，只需要输入几个步骤参数
首先打开控制器电源开关，在控制器的前端 LED 面板上会显示相关的参数。活细胞培养装置上盖和底板是同时加热，I 指示的内部探头的数值，S 指示的自己设定数值，温度控制器的 E 指示的是外部探头的温度。
ibidi活细胞工作站兼容性和概览
多孔加热板可以被放入任何规则的多格框架倒置显微镜系统中，它也适用于所有类型的显微镜观察腔。适用于ibidi所有成像耗材。
对以上产品感兴趣，可在公众号申请免费试用测试
广州科适特科学仪器有限公司是德国ibidi公司在中国区合作伙伴
如果你感兴趣请和我们联系
电话：020-38102730
服务QQ：501747125
邮箱：sales@kosterscience.com
地址：广州市天河区体育西路骏汇大厦北塔140 D房
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