GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定
（转载自：https://t.cn/A6C5407h）
前言
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由全国水产标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、广东出入境检验检疫局、福建出入境检验检疫局、江苏出入境检验检疫局、北京出入境检验检疫局、宁波出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭德华、施冰、杨惠琴、林峰、李波、张志刚、林海丹、王传现、陈鹭平、盛永刚、李耀平、杨芳、陈惠兰、张朝晖、殷居易、林立毅、袁辰刚。
本标准系首次发布的国家标准。
1范围
本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿(leucomalachite green)、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(leucocrystalviolet)残留量的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱的测定方法。
本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验。
2液相色谱-串联质谱法
2.1 原理
试样中的残留物用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层，经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
2.2试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2.2. 1乙腈：液相色谱纯。
2.2.2甲醇：液相色谱纯。
2.2.3二氯甲烷。
2.2.4无水乙酸铵。
2.2.5 5mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取38.5 g无水乙酸铵溶解于90 mL水中，冰乙酸调pH到7.0，用水定容至100 mL。
2.2.6 0.1mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取7.71 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
2.2.7 5mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取0.385 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到4.5，过0.2μm滤膜。
2.2.8冰乙酸。
2.2.9 0.25g/mL盐酸羟胺溶液。
2.2.10 1.0 mol/L对-甲苯磺酸溶液：称取17.2 g对甲苯磺酸，用水溶解并定容至100 mL。
2.2.11体积分数为2%的甲酸溶液。
2.2.12体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液：量取5mL乙酸铵缓冲溶液(2.2.5)用甲醇定容至100 mL。
2.2. 13阳离子交换柱：MCX，60mg/3mL，使用前依次用3mL乙腈、3mL甲酸溶液(2.2.11)活化。
2.2.14中性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
2.2.15标准品：孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)、同位素内标氘代孔雀石绿(D；-MG)、同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度大于98%。
2.2.16标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备液。
2.2.17混合标准储备溶液(1μg/mL)：分别准确吸取1.00mL孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的标准储备溶液(2.2.16)至100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，1 mL该溶液分别含1μg的孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫。-18℃避光保存。
2.2.18混合标准储备溶液(100ng/mL)：用乙腈稀释混合标准储备溶液(2.2.17)，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为100ng的混合标准储备溶液。-18℃避光保存。
2.2.19混合内标标准溶液：用乙腈稀释标准溶液(2.2.16)，配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各100 ng的内标混合溶液。-18℃避光保存。
2.2.20混合标准工作溶液：根据需要，临用时吸取--定量的混合标准储备溶液(2.2.18)和混合内标标准溶液(2. 2. 19)，用乙腈+5mmol/L乙酸铵溶液(1+ 1)稀释配制适当浓度的混合标准工作液，每毫升该混合标准工作溶液含有氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各2ng。
2.3仪器和设备
2.3.1高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾(ESI)离子源。
2.3.2匀浆机。
2.3.3离心机：4 000 r/ min。
2.3.4超声波水浴。
2.3.5 旋涡振荡器。
2.3.6 KD浓缩瓶：25 mL。
2.3.7固相萃取装置。
2.3.8旋转蒸发仪。
2.4样品制备
2.4.1鲜活水产品
2.4.1.1提取
称取5.00g已捣碎样品于50 mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液(2.2. 19)，加入11 mL乙腈，超声波振荡提取2 min，8 000 r/min匀浆提取30 s，4 000 r/min离心5 min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50 mL离心管加入11 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，旋涡混匀器上振荡30 s，超声波振荡5 min，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用。
2.4.1.2净化
移取5.00mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱(2.2.14)上，用KD浓缩瓶接收流出液，4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约1 mL，残液用乙腈定容至1. 00 mL，超声波振荡5min，加入1.0mL 5mmol/L乙酸铵，超声波振荡1min，样液经0.2μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。
2.4.2 加工水产品
2.4.2.1提取
称取5.00g已捣碎样品于100 mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液(2.2.19) ，依次加入1 mL盐酸羟胺(2.2.9)、2 mL对-甲苯磺酸(2.2. 10).2 mL乙酸铵缓冲溶液(2.2.6)和40 mL乙腈，匀浆2 min(10 000 r/min)，离心3 min(3 000 r/min) ，将上清液转移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水，振摇2 min，静置分层，收集下层有机层于150mL梨形瓶中，再用20mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷层，45℃旋转蒸发近干。
2.4.2.2净化
将中性氧化铝柱(2.2. 14)串接在阳离子交换柱(2.2.13)上方。用6 mL乙腈分三次(每次2 mL)，
用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物，并依次过柱，控制阳离子交换柱流速不超过0.6mL/min，再用2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3mL体积分数为2%的甲酸溶液、3mL乙腈淋洗阳离子交换柱，弃去流出液。用4 mL体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液(2. 2. 12)洗脱，洗脱流速为1 mL/min，用10 mL刻度试管收集洗脱液，用水定容至10.0 mL，样液经0.2μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。
2.5 测定
2.5.1 液相色谱-串联质谱条件
a) 色谱柱：C18柱 ，50mm×2.1mm(内径)，粒度3μm；
b) 流动相：乙腈+5mmol/L乙酸铵=75+25(体积比)；
c) 流速：0.2mL/min；
d) 柱温：35℃；
e) 进样量：10μL；
f) 离子源：电喷雾ESI，正离子；
g) 扫描方式：多反应监测MRM；
h) 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
i) 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；
j) 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313(定量离子)、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316(定量离子)、331/239；结晶紫m/z 372/356(定量离子)、372/251；隐色结晶紫m/z 374/359(定量离子)、374/238；氘代孔雀石绿m/z 334/318(定量离子)；氘代隐色孔雀石绿m/z 337/322(定量离子)。
2.5.2液相色谱-串联质谱测定
按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液(2.2.20)，以色谱峰面积按内标法定量，孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算。在上述色谱条件下孔雀石绿、氘代孔雀石绿结晶紫、氘代隐色孔雀石绿、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为2.27 min、2.30 min、2.88 min、5.21 min、5.31 min、5.61min，标准溶液的离子流图参见附录A中图A.1。
2.5.3 液相色谱-串联质谱确证
按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。
2.6空白试验
除不加试样外，均按2.4，2.5步骤进行。
2.7结果计算和表述
按式(1)计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。
式中：
X——样品中待测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c——孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
Csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
Ci——样液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
As——孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的峰面积；
A——样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫的峰面积；
Asi——标准工作溶液中内标物的峰面积；
Ai——样液中内标物的峰面积；
V——样品定容体积，单位为毫升(mL)；
m——样品称样量，单位为克(g)。
本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量之和，以孔雀石绿表示。
本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量之和，以结晶紫表示。
2.8方法检测限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为0.5ug/kg。
3高效液相色谱法
3.1 原理
试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定，外标法定量。
3.2 试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
3.2. 1乙腈：液相色谱纯。
3.2.2二氯甲烷。
3.2.3 甲醇：液相色谱纯。
3.2.4 乙酸盐缓冲液：溶解4.95 g无水乙酸钠及0.95 g对-甲苯磺酸于950 mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水稀释到1 L。
3.2.5 20%盐酸羟胺溶液。
3.2.6 1.0 mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2 g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100 mL。
3.2.7 50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到
4.5。
3.2.8二甘醇。
3.2.9 酸性氧化铝：80目~120目。
3.2.10二氧化铅。
3.2.11硅藻土545；色谱层析级。
3.2.12 标准品：孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)，纯度大于98%。
3.2.13标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备液，再用乙腈稀释配制1μg/mL的标准溶液。-18℃避光保存。
3.2.14混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液(3.2.13)，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20 ng的混合标准溶液。-18℃避光保存。
3.3仪器和设备
3.3.1高效液相色谱仪：配有紫外~可见光检测器。
3.3.2匀浆机。
3.3.3离心机：4 000 r/ min。
3.3.4固相萃取装置。
3.3.5 25%二氧化铅氧化柱：不锈钢预柱管[5cm×4mm(内径)]，两端附2μm过滤板，抽真空下，填装含有25%二氧化铅的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将二氧化铅氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。
3.3.6酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
3.4样品制备
3.4.1 提取
称取5.00g样品于50mL离心管内，加入1.5mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5mL 1.0mol/L的对-甲苯磺酸溶液5.0mL乙酸盐级冲溶液，用匀浆机以10000r/min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈震摇30s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。30000r/min离心10min。把上清液转移至装有10 mL水和2 mL二甘醇的100 mL离心管中。然后在50 mL离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。
3.4.2 净化
在离心管中加入15 mL二氯甲烷，振荡10s， 3 000 r/min离心10 min，将二氯甲烷层转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100 mL 梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1 mL，用2. 5 mL乙腈溶解残渣。
将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5mL，把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45μm滤膜，滤液供液相色谱测定。
3.5测定
3.5. 1液相色谱条件
a) 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25%二氧化铅氧化柱；
b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7)，梯度洗脱参数见表1；
c) 流速：1.0 mL/ min；
d) 柱温：室温；
e) 检测波长：618nm(孔雀石绿) ，588nm(结晶紫)；
f) 进样量：50μL。
3.5.2 液相色谱测定
根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2。
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前言
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由全国水产标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、广东出入境检验检疫局、福建出入境检验检疫局、江苏出入境检验检疫局、北京出入境检验检疫局、宁波出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭德华、施冰、杨惠琴、林峰、李波、张志刚、林海丹、王传现、陈鹭平、盛永刚、李耀平、杨芳、陈惠兰、张朝晖、殷居易、林立毅、袁辰刚。
本标准系首次发布的国家标准。
1范围
本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿(leucomalachite green)、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(leucocrystalviolet)残留量的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱的测定方法。
本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验。
2液相色谱-串联质谱法
2.1 原理
试样中的残留物用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层，经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
2.2试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2.2. 1乙腈：液相色谱纯。
2.2.2甲醇：液相色谱纯。
2.2.3二氯甲烷。
2.2.4无水乙酸铵。
2.2.5 5mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取38.5 g无水乙酸铵溶解于90 mL水中，冰乙酸调pH到7.0，用水定容至100 mL。
2.2.6 0.1mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取7.71 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
2.2.7 5mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取0.385 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到4.5，过0.2μm滤膜。
2.2.8冰乙酸。
2.2.9 0.25g/mL盐酸羟胺溶液。
2.2.10 1.0 mol/L对-甲苯磺酸溶液：称取17.2 g对甲苯磺酸，用水溶解并定容至100 mL。
2.2.11体积分数为2%的甲酸溶液。
2.2.12体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液：量取5mL乙酸铵缓冲溶液(2.2.5)用甲醇定容至100 mL。
2.2. 13阳离子交换柱：MCX，60mg/3mL，使用前依次用3mL乙腈、3mL甲酸溶液(2.2.11)活化。
2.2.14中性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
2.2.15标准品：孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)、同位素内标氘代孔雀石绿(D；-MG)、同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度大于98%。
2.2.16标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备液。
2.2.17混合标准储备溶液(1μg/mL)：分别准确吸取1.00mL孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的标准储备溶液(2.2.16)至100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，1 mL该溶液分别含1μg的孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫。-18℃避光保存。
2.2.18混合标准储备溶液(100ng/mL)：用乙腈稀释混合标准储备溶液(2.2.17)，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为100ng的混合标准储备溶液。-18℃避光保存。
2.2.19混合内标标准溶液：用乙腈稀释标准溶液(2.2.16)，配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各100 ng的内标混合溶液。-18℃避光保存。
2.2.20混合标准工作溶液：根据需要，临用时吸取--定量的混合标准储备溶液(2.2.18)和混合内标标准溶液(2. 2. 19)，用乙腈+5mmol/L乙酸铵溶液(1+ 1)稀释配制适当浓度的混合标准工作液，每毫升该混合标准工作溶液含有氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各2ng。
2.3仪器和设备
2.3.1高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾(ESI)离子源。
2.3.2匀浆机。
2.3.3离心机：4 000 r/ min。
2.3.4超声波水浴。
2.3.5 旋涡振荡器。
2.3.6 KD浓缩瓶：25 mL。
2.3.7固相萃取装置。
2.3.8旋转蒸发仪。
2.4样品制备
2.4.1鲜活水产品
2.4.1.1提取
称取5.00g已捣碎样品于50 mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液(2.2. 19)，加入11 mL乙腈，超声波振荡提取2 min，8 000 r/min匀浆提取30 s，4 000 r/min离心5 min，上清液转移至25mL比色管中；另取一50 mL离心管加入11 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，旋涡混匀器上振荡30 s，超声波振荡5 min，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用。
2.4.1.2净化
移取5.00mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱(2.2.14)上，用KD浓缩瓶接收流出液，4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约1 mL，残液用乙腈定容至1. 00 mL，超声波振荡5min，加入1.0mL 5mmol/L乙酸铵，超声波振荡1min，样液经0.2μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。
2.4.2 加工水产品
2.4.2.1提取
称取5.00g已捣碎样品于100 mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液(2.2.19) ，依次加入1 mL盐酸羟胺(2.2.9)、2 mL对-甲苯磺酸(2.2. 10).2 mL乙酸铵缓冲溶液(2.2.6)和40 mL乙腈，匀浆2 min(10 000 r/min)，离心3 min(3 000 r/min) ，将上清液转移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水，振摇2 min，静置分层，收集下层有机层于150mL梨形瓶中，再用20mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷层，45℃旋转蒸发近干。
2.4.2.2净化
将中性氧化铝柱(2.2. 14)串接在阳离子交换柱(2.2.13)上方。用6 mL乙腈分三次(每次2 mL)，
用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物，并依次过柱，控制阳离子交换柱流速不超过0.6mL/min，再用2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3mL体积分数为2%的甲酸溶液、3mL乙腈淋洗阳离子交换柱，弃去流出液。用4 mL体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液(2. 2. 12)洗脱，洗脱流速为1 mL/min，用10 mL刻度试管收集洗脱液，用水定容至10.0 mL，样液经0.2μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。
2.5 测定
2.5.1 液相色谱-串联质谱条件
a) 色谱柱：C18柱 ，50mm×2.1mm(内径)，粒度3μm；
b) 流动相：乙腈+5mmol/L乙酸铵=75+25(体积比)；
c) 流速：0.2mL/min；
d) 柱温：35℃；
e) 进样量：10μL；
f) 离子源：电喷雾ESI，正离子；
g) 扫描方式：多反应监测MRM；
h) 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
i) 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；
j) 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313(定量离子)、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316(定量离子)、331/239；结晶紫m/z 372/356(定量离子)、372/251；隐色结晶紫m/z 374/359(定量离子)、374/238；氘代孔雀石绿m/z 334/318(定量离子)；氘代隐色孔雀石绿m/z 337/322(定量离子)。
2.5.2液相色谱-串联质谱测定
按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液(2.2.20)，以色谱峰面积按内标法定量，孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算。在上述色谱条件下孔雀石绿、氘代孔雀石绿结晶紫、氘代隐色孔雀石绿、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为2.27 min、2.30 min、2.88 min、5.21 min、5.31 min、5.61min，标准溶液的离子流图参见附录A中图A.1。
2.5.3 液相色谱-串联质谱确证
按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。
2.6空白试验
除不加试样外，均按2.4，2.5步骤进行。
2.7结果计算和表述
按式(1)计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。
式中：
X——样品中待测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c——孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
Csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
Ci——样液中内标物的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
As——孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的峰面积；
A——样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫的峰面积；
Asi——标准工作溶液中内标物的峰面积；
Ai——样液中内标物的峰面积；
V——样品定容体积，单位为毫升(mL)；
m——样品称样量，单位为克(g)。
本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量之和，以孔雀石绿表示。
本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量之和，以结晶紫表示。
2.8方法检测限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为0.5ug/kg。
3高效液相色谱法
3.1 原理
试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定，外标法定量。
3.2 试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
3.2. 1乙腈：液相色谱纯。
3.2.2二氯甲烷。
3.2.3 甲醇：液相色谱纯。
3.2.4 乙酸盐缓冲液：溶解4.95 g无水乙酸钠及0.95 g对-甲苯磺酸于950 mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水稀释到1 L。
3.2.5 20%盐酸羟胺溶液。
3.2.6 1.0 mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2 g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100 mL。
3.2.7 50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85 g无水乙酸铵溶解于1000 mL水中，冰乙酸调pH到
4.5。
3.2.8二甘醇。
3.2.9 酸性氧化铝：80目~120目。
3.2.10二氧化铅。
3.2.11硅藻土545；色谱层析级。
3.2.12 标准品：孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)，纯度大于98%。
3.2.13标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备液，再用乙腈稀释配制1μg/mL的标准溶液。-18℃避光保存。
3.2.14混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液(3.2.13)，配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20 ng的混合标准溶液。-18℃避光保存。
3.3仪器和设备
3.3.1高效液相色谱仪：配有紫外~可见光检测器。
3.3.2匀浆机。
3.3.3离心机：4 000 r/ min。
3.3.4固相萃取装置。
3.3.5 25%二氧化铅氧化柱：不锈钢预柱管[5cm×4mm(内径)]，两端附2μm过滤板，抽真空下，填装含有25%二氧化铅的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将二氧化铅氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。
3.3.6酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
3.4样品制备
3.4.1 提取
称取5.00g样品于50mL离心管内，加入1.5mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5mL 1.0mol/L的对-甲苯磺酸溶液5.0mL乙酸盐级冲溶液，用匀浆机以10000r/min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈震摇30s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。30000r/min离心10min。把上清液转移至装有10 mL水和2 mL二甘醇的100 mL离心管中。然后在50 mL离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。
3.4.2 净化
在离心管中加入15 mL二氯甲烷，振荡10s， 3 000 r/min离心10 min，将二氯甲烷层转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100 mL 梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1 mL，用2. 5 mL乙腈溶解残渣。
将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5mL，把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45μm滤膜，滤液供液相色谱测定。
3.5测定
3.5. 1液相色谱条件
a) 色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25%二氧化铅氧化柱；
b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7)，梯度洗脱参数见表1；
c) 流速：1.0 mL/ min；
d) 柱温：室温；
e) 检测波长：618nm(孔雀石绿) ，588nm(结晶紫)；
f) 进样量：50μL。
3.5.2 液相色谱测定
根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2。
NY/T 1453-2007 蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定 液相色谱-质谱-质谱联用法
（转载自：https://t.cn/A6C499Hy）
前言
本标准附录A、附录B、附录C为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：农业部热带农产品质量监督检验测试中心。
本标准主要起草人：吴莉宇、徐志、韩红新、吕岱竹。
1范围
本标准规定了蔬菜、水果中多菌灵等16种农药的残留用液相色谱-质谱-质谱联用测定方法。
本标准适用于蔬菜、水果中多菌灵、杀线威、噻菌灵、灭多威、吡虫啉、啶虫脒、嘧菌酯、虱螨脲、多杀菌素、咪鲜胺、氟菌唑、氟苯脲、氟虫脲、伐虫脒、霜霉威、氟铃脲残留量的测定。
16种农药的最低检出限为0.01 mg/kg~0. 10 mg/kg。
2原理
试样用乙酸乙酯匀浆提取，过滤后的提取液浓缩，硅胶小柱净化后定容，然后采用配有电喷雾离子源液质联用仪检测，分段多事件扫描，多反应监测，外标法定量。
3规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/ T 6682分析实验用水规格和试验方法（neq ISO 3696：1987）
4试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
4.1 水，符合GB/ T 6682，二级。
4.2乙酸乙酯。
4.3甲酸。
4.4 乙腈（色谱纯）。
4.5甲醇（色谱纯）。
4.6 丙酮。
4.7 正已烷。
4.8丙酮+正己烷溶液：10+90。
4.9甲醇+丙酮溶液：50+ 50。
4.10乙酸铵。
4.11饱和无水硫酸钠溶液。
4.12固相萃取柱：硅胶填料， 500 mg，6 mL。
4.13农药标准品：纯度≥95%。
4.14标准储备液
分别称取10 mg（精确到0. 1 mg） 16种农药标准品（4.13），于50 mL烧杯中加入乙腈（4.4）或丙酮（4.6）溶解并转移进10 mL容量瓶中，并用乙腈（4.4）定容至刻度，得到上述16种农药的各自储备液。
农药储备液在避光处，4℃可保存6个月。
4.15混合标准溶液
按照每种农药在仪器上的响应，确定其在混合标准溶液中的浓度。
4.16流动相 A
准确称取0.134 g乙酸铵（4.10），溶解在1 000 mL乙腈（4.4）中，加入适量甲酸（0.15%），过0.22μm有机相滤膜。
4.17 流动相B
准确称取0. 134 g乙酸铵（4.10）溶解于1 000 mL的水中配成浓度为2 mmol/L的乙酸铵溶液，再加入1mL甲酸后，过0.22μm水相滤膜。
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
5.2高速匀浆机：最大转速24 000 r/ min。
5.3氮吹仪。
5.4旋转浓缩蒸发器 。
5.5烧杯：150 mL，高型。
5.6具塞量筒：100 mL。
6分析步骤
6.1试样制备
取不少于1000g蔬菜、水果样品，取可食部分，用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物，采用对角线分割法，取对角部分，将其切碎，充分混匀放入食品加工器粉碎，制成待测样，放入样品瓶中并置于-20℃条件下保存，待测。
6.2 提取
称取20g（精确至0.01g）试样放入150mL烧杯中，加入60mL乙酸乙酯（4.2），用匀浆机（5.2）15000r/min匀浆提取2min后用滤纸过滤，收集滤液于100mL具塞量筒（5.6）中，用40mL乙酸乙酯（4. 2）分3次淋洗残渣，并收集淋洗液于同一具塞量简（5.6）中。在室温下静置10 min，使乙酸乙酯和水相分层。如果出现乳化现象，可以加入饱和无水硫酸钠溶液（4.11）。
准确吸取50.00mL乙酸乙酯溶液于40℃旋转蒸发器浓缩至近干，用氮吹仪（5.3）吹干后，加入2 mL丙酮+正已烷溶液（4.8）溶解，待净化。
6.3净化
固相萃取柱（4.12）分别通过10 mL丙酮（4. 6），5 mL正己烷（4.7）预处理，加入（6.2）得到的溶液，再加入5 mL丙酮+正已烷溶液（4.8），舍弃流出液。20 mL甲醇+丙酮溶液（4.9）分4次加入洗脱，收集洗脱液于40℃旋转蒸发器浓缩至约2mL，用氮吹仪吹干后，加入2mL甲醇（4.5）溶解并转移至2mL容量瓶中，定容后待测定。
6.4测定
6.4.1参考条件
a） 色谱柱：AtlantisTM dC18，3μm， 150mm×2.1mm或相当者；
b） 流动相及流速见表1；
c） 进样量：10μL；
d） 扫描方式：分段多事件扫描（正离子、负离子）；
e） 检测方法：多反应监测；
f） 电喷雾电压：4900 V；
g） 雾化气压力：0. 076 MPa；
h） 离子传输毛细管温度： 250℃。
6.4.2液相流动相梯度洗脱
液相色谱流动相梯度洗脱具体见表1：
6.4.3定性
进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，而且所选择的离子丰度比与标准样品离子丰度比相-致，则可以判断样品中存在这种农药化合物。
6.4.4定量
本方法采用外标校准曲线法单离子定量测定，通过与添加到空白样品的标准工作液中各已知质量浓度16种农药的定量离子进行比较，确定试样溶液中各自农药的浓度。定量用的标准应采用基质配制。
6.5空白试验
除不加待测样品外，均按上述步骤进行操作。
6.6结果计算
试料中16种农药的含量以质量分数表示，单位为mg/ kg，按下列公式计算：
式中：
W——试样中被测组分的残留量， 单位为毫克每千克（mg/kg）；
ρ——从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——样品溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；
m——样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。
计算结果精确到小数点后两位。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于20%，以大于这两个测定值的算术平均值的20%不超过5%为前提。
（转载自：https://t.cn/A6C499Hy）
前言
本标准附录A、附录B、附录C为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：农业部热带农产品质量监督检验测试中心。
本标准主要起草人：吴莉宇、徐志、韩红新、吕岱竹。
1范围
本标准规定了蔬菜、水果中多菌灵等16种农药的残留用液相色谱-质谱-质谱联用测定方法。
本标准适用于蔬菜、水果中多菌灵、杀线威、噻菌灵、灭多威、吡虫啉、啶虫脒、嘧菌酯、虱螨脲、多杀菌素、咪鲜胺、氟菌唑、氟苯脲、氟虫脲、伐虫脒、霜霉威、氟铃脲残留量的测定。
16种农药的最低检出限为0.01 mg/kg~0. 10 mg/kg。
2原理
试样用乙酸乙酯匀浆提取，过滤后的提取液浓缩，硅胶小柱净化后定容，然后采用配有电喷雾离子源液质联用仪检测，分段多事件扫描，多反应监测，外标法定量。
3规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/ T 6682分析实验用水规格和试验方法（neq ISO 3696：1987）
4试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
4.1 水，符合GB/ T 6682，二级。
4.2乙酸乙酯。
4.3甲酸。
4.4 乙腈（色谱纯）。
4.5甲醇（色谱纯）。
4.6 丙酮。
4.7 正已烷。
4.8丙酮+正己烷溶液：10+90。
4.9甲醇+丙酮溶液：50+ 50。
4.10乙酸铵。
4.11饱和无水硫酸钠溶液。
4.12固相萃取柱：硅胶填料， 500 mg，6 mL。
4.13农药标准品：纯度≥95%。
4.14标准储备液
分别称取10 mg（精确到0. 1 mg） 16种农药标准品（4.13），于50 mL烧杯中加入乙腈（4.4）或丙酮（4.6）溶解并转移进10 mL容量瓶中，并用乙腈（4.4）定容至刻度，得到上述16种农药的各自储备液。
农药储备液在避光处，4℃可保存6个月。
4.15混合标准溶液
按照每种农药在仪器上的响应，确定其在混合标准溶液中的浓度。
4.16流动相 A
准确称取0.134 g乙酸铵（4.10），溶解在1 000 mL乙腈（4.4）中，加入适量甲酸（0.15%），过0.22μm有机相滤膜。
4.17 流动相B
准确称取0. 134 g乙酸铵（4.10）溶解于1 000 mL的水中配成浓度为2 mmol/L的乙酸铵溶液，再加入1mL甲酸后，过0.22μm水相滤膜。
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。
5.2高速匀浆机：最大转速24 000 r/ min。
5.3氮吹仪。
5.4旋转浓缩蒸发器 。
5.5烧杯：150 mL，高型。
5.6具塞量筒：100 mL。
6分析步骤
6.1试样制备
取不少于1000g蔬菜、水果样品，取可食部分，用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物，采用对角线分割法，取对角部分，将其切碎，充分混匀放入食品加工器粉碎，制成待测样，放入样品瓶中并置于-20℃条件下保存，待测。
6.2 提取
称取20g（精确至0.01g）试样放入150mL烧杯中，加入60mL乙酸乙酯（4.2），用匀浆机（5.2）15000r/min匀浆提取2min后用滤纸过滤，收集滤液于100mL具塞量筒（5.6）中，用40mL乙酸乙酯（4. 2）分3次淋洗残渣，并收集淋洗液于同一具塞量简（5.6）中。在室温下静置10 min，使乙酸乙酯和水相分层。如果出现乳化现象，可以加入饱和无水硫酸钠溶液（4.11）。
准确吸取50.00mL乙酸乙酯溶液于40℃旋转蒸发器浓缩至近干，用氮吹仪（5.3）吹干后，加入2 mL丙酮+正已烷溶液（4.8）溶解，待净化。
6.3净化
固相萃取柱（4.12）分别通过10 mL丙酮（4. 6），5 mL正己烷（4.7）预处理，加入（6.2）得到的溶液，再加入5 mL丙酮+正已烷溶液（4.8），舍弃流出液。20 mL甲醇+丙酮溶液（4.9）分4次加入洗脱，收集洗脱液于40℃旋转蒸发器浓缩至约2mL，用氮吹仪吹干后，加入2mL甲醇（4.5）溶解并转移至2mL容量瓶中，定容后待测定。
6.4测定
6.4.1参考条件
a） 色谱柱：AtlantisTM dC18，3μm， 150mm×2.1mm或相当者；
b） 流动相及流速见表1；
c） 进样量：10μL；
d） 扫描方式：分段多事件扫描（正离子、负离子）；
e） 检测方法：多反应监测；
f） 电喷雾电压：4900 V；
g） 雾化气压力：0. 076 MPa；
h） 离子传输毛细管温度： 250℃。
6.4.2液相流动相梯度洗脱
液相色谱流动相梯度洗脱具体见表1：
6.4.3定性
进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，而且所选择的离子丰度比与标准样品离子丰度比相-致，则可以判断样品中存在这种农药化合物。
6.4.4定量
本方法采用外标校准曲线法单离子定量测定，通过与添加到空白样品的标准工作液中各已知质量浓度16种农药的定量离子进行比较，确定试样溶液中各自农药的浓度。定量用的标准应采用基质配制。
6.5空白试验
除不加待测样品外，均按上述步骤进行操作。
6.6结果计算
试料中16种农药的含量以质量分数表示，单位为mg/ kg，按下列公式计算：
式中：
W——试样中被测组分的残留量， 单位为毫克每千克（mg/kg）；
ρ——从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——样品溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；
m——样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。
计算结果精确到小数点后两位。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于20%，以大于这两个测定值的算术平均值的20%不超过5%为前提。
【转载】教育与水[心]
教育学家夏丏尊先生翻译过埃迪蒙托·德·亚米契斯的《爱的教育》。
夏先生以挖池塘比喻教育，在《爱的教育》的译者序言里说：“教育好像掘池，有人说四方形好，有人说圆形好，朝三暮四地改个不休，而于池之所以为池的要素——水，反无人注意。
教育上的水是什么？
就是情，就是爱。教育没有了情爱，就成了无水的池，任你四方形也罢，圆形也罢，总逃不了一个空虚。”
作者：孺子羊 https://t.cn/A6oBXVGJ
教育学家夏丏尊先生翻译过埃迪蒙托·德·亚米契斯的《爱的教育》。
夏先生以挖池塘比喻教育，在《爱的教育》的译者序言里说：“教育好像掘池，有人说四方形好，有人说圆形好，朝三暮四地改个不休，而于池之所以为池的要素——水，反无人注意。
教育上的水是什么？
就是情，就是爱。教育没有了情爱，就成了无水的池，任你四方形也罢，圆形也罢，总逃不了一个空虚。”
作者：孺子羊 https://t.cn/A6oBXVGJ
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