#中国医药学##国医的精诚力量# 弦脉为病：
弦脉：形容患者脉相，端直以长（《素问》），如张弓弦（《脉经》）；
按之不移，绰绰如按琴瑟弦（巢氏），状若筝弦（《脉诀》）；
弦为血弱有劳伤，
弦乃肝部本脉，见于他部，则为血虚。
主盗汗，手足酸疼，皮毛枯槁。
中虚且寒停饮浆；
弦与气口相应，则饮水停积，令人中虚寒。
胸胁疼痛体拘急，
与人迎相应，则风走注痛，甚者四肢拘急，冷痹。
疟疾寒热善惊惶；
为疟为惊。
弦紧恶寒疝癖病，经络中有寒故也。
上下左右积弦长；
弦而长，为上下左右有积。
弦钩胁下痛如刺，
弦而钩，为胁下刺痛。
双弦急痛转难当。
双弦为胁下急痛，乃无水以缓之也。
转载/来自网络
你没见过的偏方、验方https://t.cn/A69svrOi
弦脉：形容患者脉相，端直以长（《素问》），如张弓弦（《脉经》）；
按之不移，绰绰如按琴瑟弦（巢氏），状若筝弦（《脉诀》）；
弦为血弱有劳伤，
弦乃肝部本脉，见于他部，则为血虚。
主盗汗，手足酸疼，皮毛枯槁。
中虚且寒停饮浆；
弦与气口相应，则饮水停积，令人中虚寒。
胸胁疼痛体拘急，
与人迎相应，则风走注痛，甚者四肢拘急，冷痹。
疟疾寒热善惊惶；
为疟为惊。
弦紧恶寒疝癖病，经络中有寒故也。
上下左右积弦长；
弦而长，为上下左右有积。
弦钩胁下痛如刺，
弦而钩，为胁下刺痛。
双弦急痛转难当。
双弦为胁下急痛，乃无水以缓之也。
转载/来自网络
你没见过的偏方、验方https://t.cn/A69svrOi
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1680-2009
蔬菜水果中多菌灵等4种苯并咪唑类农药残留量的测定
高效液相色谱法
（转载自：https://t.cn/A6CFttSt）
1范围
本标准规定了用反相离子对高效液相色谱法测定蔬菜、水果中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并咪唑残留量的方法。
本标准适用于蔬菜、水果中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并咪唑等四种苯并咪唑类农药残留量的测定。
本标准方法检出限：多菌灵为0.07mg/kg，甲基硫菌灵为0.09mg/kg，噻菌灵为0.05mg/kg，2-氨基苯并咪唑为0.10mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
样品中的多菌灵等4种苯并咪唑类农药用乙腈提取，硫酸镁盐析、净化后，经反相离子对色谱分离，多菌灵在275nm、甲基硫菌灵在265nm、噻菌灵在300nm、2-氨基苯并咪唑在275nm处检测，根据保留时间进行定性，外标法定量。
4试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1乙腈：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3丙酮：色谱纯。
4.4三乙胺：色谱纯。
4.5 磷酸。
4.6无水硫酸镁：（140±2）℃烘烤4h，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。
4.7 N -丙基乙二胺（PSA）：40μm，60A。
4.8癸烷磺酸钠：纯度≥98%。
4.9离子对试剂：吸取7.0mL磷酸于200mL水中，加入1.0g癸烷磺酸钠，溶解，再加入10.0mL三乙胺，稀释至1000 mL。
4.10多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2 -氨基苯并咪唑标准品：纯度≥98%。
4.11标准储备溶液：分别称取0.0100g（准确至0.0001g）多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并眯唑标准品，用丙酮溶解定容至100mL，配制成100mg/L的标准储备溶液，于-18℃避光保存1年。
4.12混合标准工作溶液：分别准确吸取多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并咪唑标准储备溶液0.25mL，在30℃~40℃下用氮气缓缓吹干。用4.0mL甲醇溶解，再用离子对试剂定容至10.0mL，0℃~4℃避光保存1个月。
5仪器
5.1高效液相色谱仪：带可调波长紫外检测器。
5.2高速匀浆机，转速大于10000 r/ min。
5.3氮吹仪。
5.4 离心机。
6分析步骤
6.1试样的制备
取不少于1000g样品，去除其中杂物，取可食部分，用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物，将样品缩分至250g，粉碎后密封，制成试样备用，剩余试样于-18℃保存。
6.2样品处理
6.2.1提取
称取25g试样（精确到0.01g）于100mL具塞离心管中，加入25.0mL乙腈，高速匀浆2min，加入15g无水硫酸镁，盖上盖子，剧烈振摇1min，静置30min，2500r/min离心5min，使乙腈和水相分层。
6.2.2净化
移取1. 0mL上层乙腈溶液于2 mL离心管中，加入200mg无水硫酸镁和50mg PSA，2500r/min离心5min。准确吸取0.5mL乙腈溶液，然后加入离子对试剂0.5mL，振荡后过0.45μm滤膜，待测。
6.3 测定
6.3.1色谱参考条件
6.3.1 色谱柱：C18柱，250 mm×4.6mm，5μm。
6.3.1.2检测波长：见表 1。
6.3. 1.3柱温：45℃。
6.3.1.4进样量：40μL。
6.3. 1.5流动相：甲醇+离子对试剂（40+60）。
6.3. 1.6流速：1.25mL/min。
6.3.2样品测定
按仪器条件，对标准工作液和试样溶液等体积交替进样，根据保留时间定性，外标法定量。同时做试剂空白。
image.png
7结果计算
样品中被测农药含量以质量分数ω计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算：
image.png
式中：
c——标准溶液中各农药的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
A1——样品测定液中各农药的峰面积；
A2——标准溶液中各农药的峰面积；
V——样品提取液的体积，单位为毫升（mL）；
V1——标准溶液的进样体积，单位为微升（μL）；
V——样品溶液的进样体积，单位为微升（μL）；
m——试料的质量，单位为克（g）；
f——稀释倍数，f=2。
计算结果表示到二位有效数字。样品含量超1mg/kg时表示到三位有效数字。
8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。
9色谱图
四种苯并咪唑类农药标准色谱图见图1。
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NY/T 1680-2009
蔬菜水果中多菌灵等4种苯并咪唑类农药残留量的测定
高效液相色谱法
（转载自：https://t.cn/A6CFttSt）
1范围
本标准规定了用反相离子对高效液相色谱法测定蔬菜、水果中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并咪唑残留量的方法。
本标准适用于蔬菜、水果中多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并咪唑等四种苯并咪唑类农药残留量的测定。
本标准方法检出限：多菌灵为0.07mg/kg，甲基硫菌灵为0.09mg/kg，噻菌灵为0.05mg/kg，2-氨基苯并咪唑为0.10mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
样品中的多菌灵等4种苯并咪唑类农药用乙腈提取，硫酸镁盐析、净化后，经反相离子对色谱分离，多菌灵在275nm、甲基硫菌灵在265nm、噻菌灵在300nm、2-氨基苯并咪唑在275nm处检测，根据保留时间进行定性，外标法定量。
4试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1乙腈：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3丙酮：色谱纯。
4.4三乙胺：色谱纯。
4.5 磷酸。
4.6无水硫酸镁：（140±2）℃烘烤4h，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。
4.7 N -丙基乙二胺（PSA）：40μm，60A。
4.8癸烷磺酸钠：纯度≥98%。
4.9离子对试剂：吸取7.0mL磷酸于200mL水中，加入1.0g癸烷磺酸钠，溶解，再加入10.0mL三乙胺，稀释至1000 mL。
4.10多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2 -氨基苯并咪唑标准品：纯度≥98%。
4.11标准储备溶液：分别称取0.0100g（准确至0.0001g）多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并眯唑标准品，用丙酮溶解定容至100mL，配制成100mg/L的标准储备溶液，于-18℃避光保存1年。
4.12混合标准工作溶液：分别准确吸取多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和2-氨基苯并咪唑标准储备溶液0.25mL，在30℃~40℃下用氮气缓缓吹干。用4.0mL甲醇溶解，再用离子对试剂定容至10.0mL，0℃~4℃避光保存1个月。
5仪器
5.1高效液相色谱仪：带可调波长紫外检测器。
5.2高速匀浆机，转速大于10000 r/ min。
5.3氮吹仪。
5.4 离心机。
6分析步骤
6.1试样的制备
取不少于1000g样品，去除其中杂物，取可食部分，用干净纱布轻轻擦去样品表面的附着物，将样品缩分至250g，粉碎后密封，制成试样备用，剩余试样于-18℃保存。
6.2样品处理
6.2.1提取
称取25g试样（精确到0.01g）于100mL具塞离心管中，加入25.0mL乙腈，高速匀浆2min，加入15g无水硫酸镁，盖上盖子，剧烈振摇1min，静置30min，2500r/min离心5min，使乙腈和水相分层。
6.2.2净化
移取1. 0mL上层乙腈溶液于2 mL离心管中，加入200mg无水硫酸镁和50mg PSA，2500r/min离心5min。准确吸取0.5mL乙腈溶液，然后加入离子对试剂0.5mL，振荡后过0.45μm滤膜，待测。
6.3 测定
6.3.1色谱参考条件
6.3.1 色谱柱：C18柱，250 mm×4.6mm，5μm。
6.3.1.2检测波长：见表 1。
6.3. 1.3柱温：45℃。
6.3.1.4进样量：40μL。
6.3. 1.5流动相：甲醇+离子对试剂（40+60）。
6.3. 1.6流速：1.25mL/min。
6.3.2样品测定
按仪器条件，对标准工作液和试样溶液等体积交替进样，根据保留时间定性，外标法定量。同时做试剂空白。
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7结果计算
样品中被测农药含量以质量分数ω计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算：
image.png
式中：
c——标准溶液中各农药的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
A1——样品测定液中各农药的峰面积；
A2——标准溶液中各农药的峰面积；
V——样品提取液的体积，单位为毫升（mL）；
V1——标准溶液的进样体积，单位为微升（μL）；
V——样品溶液的进样体积，单位为微升（μL）；
m——试料的质量，单位为克（g）；
f——稀释倍数，f=2。
计算结果表示到二位有效数字。样品含量超1mg/kg时表示到三位有效数字。
8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。
9色谱图
四种苯并咪唑类农药标准色谱图见图1。
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GB 29682-2013 食品安全国家标准 水产品中青霉素类药物多残留的测定
高效液相色谱法
（转载自：https://t.cn/A6CkAW5P）
1范围
本标准规定了水产品中4种青霉素类药物残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本标准适用于鱼可食性组织中青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素单个或多个药物残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试料中残留的青霉素类药物，用乙腈提取，HLB柱净化，1,2,4-三氮唑和氯化汞溶液衍生，高效液相色谱-紫外测定，外标法定量。
4试剂与材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水应符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准品：含量≥98%。
4.2 甲醇。
4.3 乙腈。
4.4五水硫代硫酸钠。
4.5二水磷酸二氢钠。
4.6无水磷酸氢二钠 。
4.7硫酸铵。
4.8氢氧化钠。
4.9正己烷。
4.10 1,2,4-三氮唑。
4.11氯化汞（Ⅱ）。
4.12 HLB固相萃取柱：60mg/3mL，或相当者。
4.13流动相A：取五水硫代硫酸钠3.9 g，用水溶解，再加入二水磷酸二氢钠10.2 g、无水磷酸氢二钠4.9 g、硫酸铵6.8 g，用水溶解，并稀释至1 000 mL，滤膜过滤。
4.14氯化汞（Ⅱ）溶液：取氯化汞（Ⅱ）0.27 g，用水溶解并稀释至10 mL，现配现用。
4.15 5mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠20 g，用水溶解并稀释至100 mL。
4.16衍生化试剂：取1,2,4-三氮唑13.78g，用水60mL溶解，加氯化汞溶液10mL，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水稀释到100 mL。2℃~8℃避光保存，有效期3个月。
4.17 1mg/mL青霉素类药物标准贮备液：精密称取青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素的标准品各10mg，分别于10mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准贮备液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
4.18 10μg/mL青霉素G标准工作液：精密量取1mg/mL青霉素G标准贮备液1.0mL，于100mL
量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的青霉素G标准工作液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
4.19 10μg/mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液：精密量取1mg/mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准贮备液各1.0mL，于100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。
5.2分析天平：感量0.00001 g。
5.3天平：感量0.01g。
5.4冷冻高速离心机。
5.5恒温水浴锅。
5.6旋涡混合器。
5.7固相萃取装置。
5.8组织匀浆机。
5.9氮气吹干装置。
5.10 离心管：50mL。
5.11 滤膜：0.45μm。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
鱼去鳞、去皮，沿背部取肌肉组织，或取鱼肌肉+皮组织，绞碎，并使均质。
——取均质后的供试样品，作为供试试料。
——取均质后的空白样品，作为空白试料。
——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-20℃以下保存。
7测定步骤
7.1标准曲线的制备
分别精密量取10μg/mL青霉素G标准工作液及10μg/ mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液适量，用流动相稀释，配制成青霉素G依度为20、50、100、200、400、800和1600μg/，苯唑西林双氯青霉素和乙氧萘青霉素浓度为100、200、400、800、1600、3200和6400μg/L的系列青霉素类药物混合标准溶液，各取500μL，按衍生化步骤操作，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.2提取
称取试料5g±0.05g，于50mL离心管中，加乙腈15mL，混匀，加正己烷5mL，旋涡混匀，6000 r/min离心15min，弃正己烷层液，取下层液，于另一离心管中。残渣中再加乙腈10mL、正己烷5 mL，旋涡混匀，6000r/min离心15min，弃正已烷层液，合并两次下层液，于40℃水浴旋转蒸干，用水5mL溶解残余物，备用。
7.3净化
HLB柱依次用甲醇3mL和水3mL活化，取备用液过柱，用水1 mL淋洗，乙腈3 mL洗脱，收集洗脱液，于45℃~50℃水浴氮气吹干。用流动相1.0 mL溶解残余物，旋涡混匀，备用。
7.4衍生化
准确量取备用液500μL，于1.5mL聚丙烯离心管中，加衍生化试剂500μL，旋涡混匀，于65℃水浴反应10min，快速冰浴冷却，于4℃ 10000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱测定。
7.5测定
7.5.1色谱条件
7.5.1.1色谱柱：C18（250mm×4.6mm，粒径5μm） ，或相当者。
7.5.1.2流动相： 流动相A+乙腈（65+ 35，体积比）。
7.5.1.3流速：1mL/min。
7.5.1.4紫外检测波长：325 nm。
7.5.1.5柱温：30℃。
7.5.1.6进样量：50μL。
7.5.2测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中青霉素类药物响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和空白添加试样溶液的高效液相色谱图见附录A。
7.6空白试验
除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
8结果计算和表述
试料中青霉素类药物的残留量（μg/kg）按式（1）计算：
image.png
式中：
X——供试试料中相应的青霉素类药物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
A——试样溶液中相应的青霉素类药物衍生物峰面积；
cS——标准工作液中相应的青霉素类药物浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V——衍生化后所得溶液总体积，单位为毫升（mL）；
AS——标准工作液中相应的青霉素类药物衍生物峰面积；
m——供试试料质量，单位为克（g）。
注；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
9检验方法灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法青霉素G的检测限为3μg/kg，定量限为10μg/kg，苯唑西林、双氯青霉素，乙氧萘青霉素的检测限为10μg/kg，定量限为50μg/kg。
9.2 准确度
本方法在10μg/kg~600μg/kg添加浓度水平上的回收率为70% ~110%。
9.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
高效液相色谱法
（转载自：https://t.cn/A6CkAW5P）
1范围
本标准规定了水产品中4种青霉素类药物残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本标准适用于鱼可食性组织中青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素单个或多个药物残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试料中残留的青霉素类药物，用乙腈提取，HLB柱净化，1,2,4-三氮唑和氯化汞溶液衍生，高效液相色谱-紫外测定，外标法定量。
4试剂与材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水应符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准品：含量≥98%。
4.2 甲醇。
4.3 乙腈。
4.4五水硫代硫酸钠。
4.5二水磷酸二氢钠。
4.6无水磷酸氢二钠 。
4.7硫酸铵。
4.8氢氧化钠。
4.9正己烷。
4.10 1,2,4-三氮唑。
4.11氯化汞（Ⅱ）。
4.12 HLB固相萃取柱：60mg/3mL，或相当者。
4.13流动相A：取五水硫代硫酸钠3.9 g，用水溶解，再加入二水磷酸二氢钠10.2 g、无水磷酸氢二钠4.9 g、硫酸铵6.8 g，用水溶解，并稀释至1 000 mL，滤膜过滤。
4.14氯化汞（Ⅱ）溶液：取氯化汞（Ⅱ）0.27 g，用水溶解并稀释至10 mL，现配现用。
4.15 5mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠20 g，用水溶解并稀释至100 mL。
4.16衍生化试剂：取1,2,4-三氮唑13.78g，用水60mL溶解，加氯化汞溶液10mL，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0，用水稀释到100 mL。2℃~8℃避光保存，有效期3个月。
4.17 1mg/mL青霉素类药物标准贮备液：精密称取青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素的标准品各10mg，分别于10mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的青霉素G、苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准贮备液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
4.18 10μg/mL青霉素G标准工作液：精密量取1mg/mL青霉素G标准贮备液1.0mL，于100mL
量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的青霉素G标准工作液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
4.19 10μg/mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液：精密量取1mg/mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素标准贮备液各1.0mL，于100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL的苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液，分装，立刻于-20℃以下避光保存，有效期1个月。使用时不得反复冻融。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。
5.2分析天平：感量0.00001 g。
5.3天平：感量0.01g。
5.4冷冻高速离心机。
5.5恒温水浴锅。
5.6旋涡混合器。
5.7固相萃取装置。
5.8组织匀浆机。
5.9氮气吹干装置。
5.10 离心管：50mL。
5.11 滤膜：0.45μm。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
鱼去鳞、去皮，沿背部取肌肉组织，或取鱼肌肉+皮组织，绞碎，并使均质。
——取均质后的供试样品，作为供试试料。
——取均质后的空白样品，作为空白试料。
——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-20℃以下保存。
7测定步骤
7.1标准曲线的制备
分别精密量取10μg/mL青霉素G标准工作液及10μg/ mL苯唑西林、双氯青霉素和乙氧萘青霉素混合标准工作液适量，用流动相稀释，配制成青霉素G依度为20、50、100、200、400、800和1600μg/，苯唑西林双氯青霉素和乙氧萘青霉素浓度为100、200、400、800、1600、3200和6400μg/L的系列青霉素类药物混合标准溶液，各取500μL，按衍生化步骤操作，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.2提取
称取试料5g±0.05g，于50mL离心管中，加乙腈15mL，混匀，加正己烷5mL，旋涡混匀，6000 r/min离心15min，弃正己烷层液，取下层液，于另一离心管中。残渣中再加乙腈10mL、正己烷5 mL，旋涡混匀，6000r/min离心15min，弃正已烷层液，合并两次下层液，于40℃水浴旋转蒸干，用水5mL溶解残余物，备用。
7.3净化
HLB柱依次用甲醇3mL和水3mL活化，取备用液过柱，用水1 mL淋洗，乙腈3 mL洗脱，收集洗脱液，于45℃~50℃水浴氮气吹干。用流动相1.0 mL溶解残余物，旋涡混匀，备用。
7.4衍生化
准确量取备用液500μL，于1.5mL聚丙烯离心管中，加衍生化试剂500μL，旋涡混匀，于65℃水浴反应10min，快速冰浴冷却，于4℃ 10000r/min离心10min，取上清液，供高效液相色谱测定。
7.5测定
7.5.1色谱条件
7.5.1.1色谱柱：C18（250mm×4.6mm，粒径5μm） ，或相当者。
7.5.1.2流动相： 流动相A+乙腈（65+ 35，体积比）。
7.5.1.3流速：1mL/min。
7.5.1.4紫外检测波长：325 nm。
7.5.1.5柱温：30℃。
7.5.1.6进样量：50μL。
7.5.2测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中青霉素类药物响应值应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和空白添加试样溶液的高效液相色谱图见附录A。
7.6空白试验
除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。
8结果计算和表述
试料中青霉素类药物的残留量（μg/kg）按式（1）计算：
image.png
式中：
X——供试试料中相应的青霉素类药物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
A——试样溶液中相应的青霉素类药物衍生物峰面积；
cS——标准工作液中相应的青霉素类药物浓度，单位为微克每升（μg/L）；
V——衍生化后所得溶液总体积，单位为毫升（mL）；
AS——标准工作液中相应的青霉素类药物衍生物峰面积；
m——供试试料质量，单位为克（g）。
注；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
9检验方法灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法青霉素G的检测限为3μg/kg，定量限为10μg/kg，苯唑西林、双氯青霉素，乙氧萘青霉素的检测限为10μg/kg，定量限为50μg/kg。
9.2 准确度
本方法在10μg/kg~600μg/kg添加浓度水平上的回收率为70% ~110%。
9.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
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