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腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。虽然一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、上呼吸道或眼部上皮细胞的急性感染；但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介导的基因治疗可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收，或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得基因治疗方案易于推广应用。

技术原理

腺病毒（Adenovirus）是一种无包膜的双链线性DNA病毒，基因组长约36 kb，衣壳呈规则的20面体结构。腺病毒外源基因装载容量大，且能够感染绝大多数哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的细胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒适用于在难以转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因和in vivo实验。

常用重组腺病毒系统组成：腺病毒骨架载体（携带腺病毒主要功能基因）、穿梭载体（转移外源基因表达盒到骨架载体上）。目前应用较为广泛的是AdMax腺病毒载体系统，骨架质粒和穿梭载体共转染293细胞后，在细胞内中通过Cre/loxP实现载体重组，进而产生重组腺病毒。通过裂解细胞收获病毒粒子，病毒粒子经过反复扩增与纯化可得到高滴度的腺病毒。

技术流程

1、目的载体制备

构建携带靶基因ORF序列的pEnter穿梭质粒。

2、细胞转染

将上述穿梭质粒与腺病毒骨架质粒（pAD）共转染HEK293细胞，进行ORF同源重组和腺病毒包装。

3、毒种收获

转染后约14天进行出毒判定，收集有CPE（细胞病变）的细胞进行大量扩增。

4、纯化浓缩

采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对腺病毒进行纯化，浓缩后得到高滴度的腺病毒保存液。

5、滴度检测

去除游离DNA分子和病毒蛋白外壳后，采用QPCR等方法对腺病毒保存液进行滴度测定。

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