学会毕业无忧，双荧光素酶实验原理及结果解读
双荧光素酶实验的原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。同时，为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
双萤光素酶实验的具体步骤
1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。
2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。
Luciferase活性测定：
⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。
⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。
结果解读
文献一：PMID: 28697764；IF=41.444
（1）方法
（2）结果
验证linc00673和miR-150-5p的结合情况。野生型linc00673可与miR-150-5p结合，但突变型linc00673却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与linc00673基因链接，然后转染到细胞内检测荧光活性。结果表明，miR-150-5p mimics显著降低了野生型linc00673的荧光素酶活性，但对突变型linc00673荧光素酶活性没有影响。以上结果表明，linc00673可与miR-150-5p结合。
文献二：PMID: 35963157；IF=5.741
（1）方法
（2）结果：
验证YAF2和miR-217-5p的结合情况。野生型YAF2可与miR-217-5p结合，但突变型YAF2却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与YAF2基因链接，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-217-5p mimics显著降低了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2荧光素酶活性没有影响。以上结果表明，YAF2可与miR-217-5p结合。
文献三：PMID: 35212607；IF=6.832
（1）方法
（2）结果
本研究验证了PEG10和miR-449a以及RPS2与miR-449a的结合情况。这里以PEG10和miR-449a为例。野生型PEG10可与miR-449a结合，但突变型PEG10却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与PEG10基因链接，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-449a mimics显著降低了野生型PEG10的荧光素酶活性，但对突变型PEG10荧光素酶活性没有影响。证明PEG10与miR-449a靶向结合。
文献四：PMID: 35110549；IF=9.685
（1）方法
（2）结果
验证PAARH和HOTTIP分别与六种miRNA的结合。以上结果显示，miRNA转染组的荧光活性显著降低，表明miRNA与PAARH和HOTTIP之间存在靶向结合。
注意该研究中没有突变型的结果，这样的例子很少，一般荧光素酶的结果是需要包括突变型和野生型的，自己设计实验的时候注意一下。
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双荧光素酶实验的原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。同时，为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
双萤光素酶实验的具体步骤
1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。
2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。
Luciferase活性测定：
⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。
⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。
结果解读
文献一：PMID: 28697764；IF=41.444
（1）方法
（2）结果
验证linc00673和miR-150-5p的结合情况。野生型linc00673可与miR-150-5p结合，但突变型linc00673却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与linc00673基因链接，然后转染到细胞内检测荧光活性。结果表明，miR-150-5p mimics显著降低了野生型linc00673的荧光素酶活性，但对突变型linc00673荧光素酶活性没有影响。以上结果表明，linc00673可与miR-150-5p结合。
文献二：PMID: 35963157；IF=5.741
（1）方法
（2）结果：
验证YAF2和miR-217-5p的结合情况。野生型YAF2可与miR-217-5p结合，但突变型YAF2却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与YAF2基因链接，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-217-5p mimics显著降低了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2荧光素酶活性没有影响。以上结果表明，YAF2可与miR-217-5p结合。
文献三：PMID: 35212607；IF=6.832
（1）方法
（2）结果
本研究验证了PEG10和miR-449a以及RPS2与miR-449a的结合情况。这里以PEG10和miR-449a为例。野生型PEG10可与miR-449a结合，但突变型PEG10却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与PEG10基因链接，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-449a mimics显著降低了野生型PEG10的荧光素酶活性，但对突变型PEG10荧光素酶活性没有影响。证明PEG10与miR-449a靶向结合。
文献四：PMID: 35110549；IF=9.685
（1）方法
（2）结果
验证PAARH和HOTTIP分别与六种miRNA的结合。以上结果显示，miRNA转染组的荧光活性显著降低，表明miRNA与PAARH和HOTTIP之间存在靶向结合。
注意该研究中没有突变型的结果，这样的例子很少，一般荧光素酶的结果是需要包括突变型和野生型的，自己设计实验的时候注意一下。
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抑郁症
中医称抑郁症为“郁证”、“邪崇病”、“卑蝶”等。《素问阴阳应象大论》中把五志归属于五脏：肝在志为怒，怒伤肝，悲胜怒；心在志为喜，喜伤心，恐胜喜；脾在志为思，思伤脾，怒胜思；肺在志为忧，忧伤肺，喜胜忧；肾在志为恐，恐伤肾，思胜恐。
病机：七情所扰，病归于肝。中医将抑郁症的基本病机归于肝气郁结，进而可以发生肝气乘脾、肝损及肾，气滞痰凝、血瘀，因实致虚等病机变化。《丹溪心法》指出“气血冲和，万病不生。”故人身诸病多生于郁。
病因：情志内郁，心脾两亏，兼有血瘀、化火、痰结等，病理变化和心、肝、脾、肾均有关。
症状：烦燥不安，情绪低落、喜怒无常、少寐多梦、急躁易怒、失眠头痛等症状。《读医随笔》指出“凡脏腑十二经之气化，皆必籍肝之气化以鼓舞之，始能调畅而不病”，还指出：“医者善于调肝，乃善治百病。”
辩证思路
总之抑郁症的发生多因郁怒、思虑、悲哀、忧愁等七情所伤，导致肝失疏泄，脾失健运，心失所养，脏腑阴阳气血失调而成。临床治疗多以疏肝理气为主，依据其病情分别配以行血、化痰、利湿、清热、益气养血等治法。
刮痧方案
1、手三阴、大肠经、三焦经。内关、太渊、极泉、通里、神门、支沟重刮。
2、头部，百会、四神聪、率谷、角孙。
3、颈椎，风府，风池，天柱，颈动脉，椎动脉全部刮透，安眠穴扣进去刮。颈椎第一节是管脑垂体，气血和神经通达以后，有宁心安神的功能。
4、督脉膀胱经，两肋，肺肝脾肾同时治，重点是肝。
5、胸腺、天突到膻中，鸠尾、巨阙、中脘、期门、乳根、天枢、关元。
6、小腿胃经，胆经，肝经，脾经。足三里、下足三里，上巨虚、下巨虚、三阴交、太冲、足临泣，这些穴位重刮。
7、太溪、复溜、申脉、照海、公孙、太白、地筋，四井排毒
#日常分享##抑郁##微博健康公开课#
中医称抑郁症为“郁证”、“邪崇病”、“卑蝶”等。《素问阴阳应象大论》中把五志归属于五脏：肝在志为怒，怒伤肝，悲胜怒；心在志为喜，喜伤心，恐胜喜；脾在志为思，思伤脾，怒胜思；肺在志为忧，忧伤肺，喜胜忧；肾在志为恐，恐伤肾，思胜恐。
病机：七情所扰，病归于肝。中医将抑郁症的基本病机归于肝气郁结，进而可以发生肝气乘脾、肝损及肾，气滞痰凝、血瘀，因实致虚等病机变化。《丹溪心法》指出“气血冲和，万病不生。”故人身诸病多生于郁。
病因：情志内郁，心脾两亏，兼有血瘀、化火、痰结等，病理变化和心、肝、脾、肾均有关。
症状：烦燥不安，情绪低落、喜怒无常、少寐多梦、急躁易怒、失眠头痛等症状。《读医随笔》指出“凡脏腑十二经之气化，皆必籍肝之气化以鼓舞之，始能调畅而不病”，还指出：“医者善于调肝，乃善治百病。”
辩证思路
总之抑郁症的发生多因郁怒、思虑、悲哀、忧愁等七情所伤，导致肝失疏泄，脾失健运，心失所养，脏腑阴阳气血失调而成。临床治疗多以疏肝理气为主，依据其病情分别配以行血、化痰、利湿、清热、益气养血等治法。
刮痧方案
1、手三阴、大肠经、三焦经。内关、太渊、极泉、通里、神门、支沟重刮。
2、头部，百会、四神聪、率谷、角孙。
3、颈椎，风府，风池，天柱，颈动脉，椎动脉全部刮透，安眠穴扣进去刮。颈椎第一节是管脑垂体，气血和神经通达以后，有宁心安神的功能。
4、督脉膀胱经，两肋，肺肝脾肾同时治，重点是肝。
5、胸腺、天突到膻中，鸠尾、巨阙、中脘、期门、乳根、天枢、关元。
6、小腿胃经，胆经，肝经，脾经。足三里、下足三里，上巨虚、下巨虚、三阴交、太冲、足临泣，这些穴位重刮。
7、太溪、复溜、申脉、照海、公孙、太白、地筋，四井排毒
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【佳学基因检测】甲基丙二酸血症怎么做基因检测？
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甲基丙二酸血症是由基因突变引起的吗?
甲基丙二酸血症是由基因突变引起的遗传性疾病。甲基丙二酸血症是一种罕见的代谢性疾病，主要由于甲基丙二酸羧化酶（MPC）基因的突变导致该酶功能异常或缺失。这种突变会影响身体对甲基丙二酸的代谢，导致甲基丙二酸在体内积累，从而引起一系列症状和并发症。甲基丙二酸血症是一种代谢性疾病，也被称为二羟基丙酸血症或Methylmalonic Acidemia（MMA）。它是由于甲基丙二酸（Methylmalonic Acid）在体内无法正常代谢而导致血液中甲基丙二酸水平升高引起的。 甲基丙二酸血症的其他中文名称包括： 二羟基丙酸尿症 甲基丙二酸尿症 甲基丙二酸血症 英文名称包括： Methylmalonic Acidemia（MMA） Methylmalonic Aciduria Methylmalonate Semialdehyde Dehydrogenase Deficiency 这些名称都指代同一种疾病，即甲基丙二酸血症。
除了基因序列变化可以引起甲基丙二酸血症外，还有什么原因可以引起?
除了基因序列变化，甲基丙二酸血症还可以由以下原因引起： 1. 营养不良：缺乏甲基丙二酸代谢所需的营养物质，如维生素B12、叶酸等。但是基因解码认为，营养不良的很多因素也是由基因决定的。如基因序列的变化决定长期的食欲水平。与不同食物的代谢有关的基因突变决定这一类物质的吸收利用水平。 2. 肝脏疾病：肝脏是甲基丙二酸代谢的重要器官，肝脏疾病如肝功能不全、肝炎等可以导致甲基丙二酸血症。 3. 肾脏疾病：肾脏是甲基丙二酸的排泄器官，肾脏疾病如慢性肾功能衰竭、肾小球肾炎等可以导致甲基丙二酸血症。 4. 药物或毒物：某些药物或毒物的使用或暴露也可能导致甲基丙二酸血症，如异丙醇、异丙醚等。 5. 其他疾病：某些遗传性代谢疾病、肿瘤等也可能引起甲基丙二酸血症。 需要注意的是，甲基丙二酸血症的具体原因可能因个体差异而有所不同，因此在确诊和治疗时需要进行详细的病因分析。
是不是所有的甲基丙二酸血症都会遗传到下一代？
不是所有的甲基丙二酸血症都会遗传到下一代。甲基丙二酸血症是一种遗传性代谢疾病，通常由基因突变引起。然而，遗传疾病的传递方式取决于具体的遗传模式。有些甲基丙二酸血症是常染色体隐性遗传，需要两个携带突变基因的父母才能将疾病传递给子女。而有些甲基丙二酸血症是常染色体显性遗传，只需要一个携带突变基因的父母就能将疾病传递给子女。此外，还有一些甲基丙二酸血症是由随机突变引起的，不会遗传给下一代。因此，是否会遗传到下一代取决于具体的遗传模式和家族史。但是没有遗传到疾病症状，并不表明没有成为基因携带者。虽然没有遗传到发病的可能性，但是如果是致病基因携带者，也可能将疾病遗传给下一代。
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甲基丙二酸血症是由基因突变引起的吗?
甲基丙二酸血症是由基因突变引起的遗传性疾病。甲基丙二酸血症是一种罕见的代谢性疾病，主要由于甲基丙二酸羧化酶（MPC）基因的突变导致该酶功能异常或缺失。这种突变会影响身体对甲基丙二酸的代谢，导致甲基丙二酸在体内积累，从而引起一系列症状和并发症。甲基丙二酸血症是一种代谢性疾病，也被称为二羟基丙酸血症或Methylmalonic Acidemia（MMA）。它是由于甲基丙二酸（Methylmalonic Acid）在体内无法正常代谢而导致血液中甲基丙二酸水平升高引起的。 甲基丙二酸血症的其他中文名称包括： 二羟基丙酸尿症 甲基丙二酸尿症 甲基丙二酸血症 英文名称包括： Methylmalonic Acidemia（MMA） Methylmalonic Aciduria Methylmalonate Semialdehyde Dehydrogenase Deficiency 这些名称都指代同一种疾病，即甲基丙二酸血症。
除了基因序列变化可以引起甲基丙二酸血症外，还有什么原因可以引起?
除了基因序列变化，甲基丙二酸血症还可以由以下原因引起： 1. 营养不良：缺乏甲基丙二酸代谢所需的营养物质，如维生素B12、叶酸等。但是基因解码认为，营养不良的很多因素也是由基因决定的。如基因序列的变化决定长期的食欲水平。与不同食物的代谢有关的基因突变决定这一类物质的吸收利用水平。 2. 肝脏疾病：肝脏是甲基丙二酸代谢的重要器官，肝脏疾病如肝功能不全、肝炎等可以导致甲基丙二酸血症。 3. 肾脏疾病：肾脏是甲基丙二酸的排泄器官，肾脏疾病如慢性肾功能衰竭、肾小球肾炎等可以导致甲基丙二酸血症。 4. 药物或毒物：某些药物或毒物的使用或暴露也可能导致甲基丙二酸血症，如异丙醇、异丙醚等。 5. 其他疾病：某些遗传性代谢疾病、肿瘤等也可能引起甲基丙二酸血症。 需要注意的是，甲基丙二酸血症的具体原因可能因个体差异而有所不同，因此在确诊和治疗时需要进行详细的病因分析。
是不是所有的甲基丙二酸血症都会遗传到下一代？
不是所有的甲基丙二酸血症都会遗传到下一代。甲基丙二酸血症是一种遗传性代谢疾病，通常由基因突变引起。然而，遗传疾病的传递方式取决于具体的遗传模式。有些甲基丙二酸血症是常染色体隐性遗传，需要两个携带突变基因的父母才能将疾病传递给子女。而有些甲基丙二酸血症是常染色体显性遗传，只需要一个携带突变基因的父母就能将疾病传递给子女。此外，还有一些甲基丙二酸血症是由随机突变引起的，不会遗传给下一代。因此，是否会遗传到下一代取决于具体的遗传模式和家族史。但是没有遗传到疾病症状，并不表明没有成为基因携带者。虽然没有遗传到发病的可能性，但是如果是致病基因携带者，也可能将疾病遗传给下一代。
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