细胞自噬检测方法#自噬##细胞自噬#

细胞自噬（autophagy=self-eating）意为自体吞噬，是真核细胞在细胞自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）的调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程。在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下细胞自噬活性会显著上调。另外，细胞自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和传染病等。鉴于细胞自噬与不同的生理和病理生理过程之间存在紧密联系，故科学工作者需要选择理想的细胞自噬检测方法。细胞经细胞自噬诱导或抑制后，常用的观察和检测方法有∶

1、透射电镜法

细胞自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察细胞自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。

2、荧光显微镜观察法

LC3（light chain 3）全称MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，贯穿整个细胞自噬过程，是目前公认的细胞自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的细胞自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B应用最为广泛。
LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I。在细胞自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于细胞自噬体内外膜上。细胞自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致细胞自噬溶酶体中LC3含量很低。因此，科研工作者可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，即可实现对细胞自噬发生的检测。

GFP-LC3单荧光和mCherry-GFP-LC3双荧光指示系统

细胞自噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白转移至细胞自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。当细胞自噬溶酶体形成后，酸性的溶酶体环境使GFP荧光淬灭，而mCherry荧光不受影响，细胞自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，科研工作者可以通过LC3荧光指示系统来监测细胞自噬流。

3、Western Blot检测LC3和p62蛋白的表达量

① 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价细胞自噬形成。细胞自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此可以通过LC3-II/I比值的大小估计细胞自噬水平的高低。

② 除LC3外，其他细胞自噬底物表达量的变化也可以用于监测细胞自噬流。其中，p62是研究广泛的一个细胞自噬底物。p62（也称为SQSTM1蛋白），由以下三个结构域组成：N端Phox和Bem1 (PB1)结构域、锌指结构域和C端泛素相关(UBA)结构域。研究表明，p62蛋白锌指结构域和UBA结构域之间的连接区域（LRS区域）负责与细胞自噬受体蛋白 Atg8/LC3结合，UBA结构域负责招募泛素化蛋白。在细胞自噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进细胞自噬体，之后被细胞自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解，所以p62蛋白的表达量与细胞自噬活性呈现负相关。因此，利用Western Blot检测p62蛋白的表达量也可以用来评价细胞自噬水平。

4、基于Keima蛋白的细胞自噬评价

Keima是一种PH敏感型的荧光蛋白，其双峰激发光谱依赖于周围的pH值，在中性和酸性环境中分别在440 nm和586 nm处激活。Keima在中性和酸性pH中荧光信号不同的特性，可以直观地反映细胞自噬程度。将细胞质的Keima传递到溶酶体可反映非选择性细胞自噬，将Keima融合到特定的蛋白(如融合到线粒体靶向序列—mt-Keima，作为线粒体细胞自噬标记)可用于反映选择性细胞自噬。值得注意是，基于keima的检测不能在固定细胞中进行，因为这种检测完全依赖于溶酶体的酸性。

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