#沉默的大多数#
A friend of mine jumped the queue in Inner Mongolia, and he told me that there must be no donkeys on the grassland.
If there is, all the horses will be "blown up". The reason is this: the kind animal with long ears from the inland came to the grassland and swallowed the horses, thinking that he had seen his cousin and ran over happily; and the horse on the grassland had never seen such a thing, thinking that the water was the devil and was scared away. So one side was eager to recognize his cousin, and the other side was eager to hide from ghosts, and he was exhausted. Modern times
Since then, there is indeed a long-eared monster that has run through the wilderness of China and disrupted the herd of horses here. It is the wisdom of the West. If this horse can be drained away, it's easy. The same topic lies in the fact that the machine does not leave. So there are all kinds of plans for donkeys: kill it, get rid of it, and let it match the horse with mules. No one is successful. Now we hope that the donkey and the horse can get along well, which is probably impossible.
Where there are donkeys, horses can't be raised. In fact, Ma's opinion is the most correct on this issue:
To Mami, the donkey is indeed a terrible monster.
Let's take a look at the strangeness of the donkey. In those years, Euclid talked about geometry, and some students asked questions.
Dao, what benefits can this knowledge bring? Euclid asked the slave to give him a dollar and satirized him:
This gentleman needs to find benefits from knowledge! Many years later, Faraday found electromagnetic induction and demonstrated it to others. A woman said: What's the use of this? Faraday asked: What's the use of a newborn child? According to the Chinese standard, this student and Feifu are reasonable, and Euclid and Faraday are unreasonable: learning for application, and useless learning can not be called learning. The wise men of the West
Standing in the Ersha of the North Division
Babon, American, Oclid, and Raday.
A friend of mine jumped the queue in Inner Mongolia, and he told me that there must be no donkeys on the grassland.
If there is, all the horses will be "blown up". The reason is this: the kind animal with long ears from the inland came to the grassland and swallowed the horses, thinking that he had seen his cousin and ran over happily; and the horse on the grassland had never seen such a thing, thinking that the water was the devil and was scared away. So one side was eager to recognize his cousin, and the other side was eager to hide from ghosts, and he was exhausted. Modern times
Since then, there is indeed a long-eared monster that has run through the wilderness of China and disrupted the herd of horses here. It is the wisdom of the West. If this horse can be drained away, it's easy. The same topic lies in the fact that the machine does not leave. So there are all kinds of plans for donkeys: kill it, get rid of it, and let it match the horse with mules. No one is successful. Now we hope that the donkey and the horse can get along well, which is probably impossible.
Where there are donkeys, horses can't be raised. In fact, Ma's opinion is the most correct on this issue:
To Mami, the donkey is indeed a terrible monster.
Let's take a look at the strangeness of the donkey. In those years, Euclid talked about geometry, and some students asked questions.
Dao, what benefits can this knowledge bring? Euclid asked the slave to give him a dollar and satirized him:
This gentleman needs to find benefits from knowledge! Many years later, Faraday found electromagnetic induction and demonstrated it to others. A woman said: What's the use of this? Faraday asked: What's the use of a newborn child? According to the Chinese standard, this student and Feifu are reasonable, and Euclid and Faraday are unreasonable: learning for application, and useless learning can not be called learning. The wise men of the West
Standing in the Ersha of the North Division
Babon, American, Oclid, and Raday.
巴菲特：We made a sizable acquisition in 1991—the H. H. Brown Company，the leading North American manufacturer of work shoes and boots, and it has a history of earning unusually fine margins on sales and assets.
淡泊人生：巴菲特用很多的钱买了布朗鞋业。从品牌地位上来看，它是北美的领导品牌。从利润表上来看表现非常好，从资产上来看也是非常完美。等最终这家企业价值归零。因为在巴菲特买了这家企业以后。因为中国的其他国家劳动力实在是太便宜了，让布朗鞋业根本没有竞争力。所以我们做投资，看历史业绩非常重要，但更重要的是能够展望将来。展望将来才是一个人做好投资的核心竞争力。如何才能更好地展望将来，这就必须来源于能力圈，必须要多阅读多思考。用道德经的话来说，就是常道不离辎重。
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#AME资讯# https://t.cn/A6YN3H9q
MiR-29c-3p和MiR-223-3p通过靶向ANGPTL4调控口腔鳞状细胞癌的增殖和耐药性
背景：本研究旨在确定血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）中的表达和功能，并探究miR-29C-3p和miR-223-3p是否可以通过靶向ANGPTL4调控OSCC的增殖和顺铂耐药性。
方法：首先在生物信息学数据库中预测肿瘤中ANGPTL4和microRNAs（miRNAs）的表达，随后通过Western blot和qPCR检测组织和细胞中ANGPTL4和miRNA的蛋白质、mRNA表达水平。通过平板克隆形成、CCK-8实验和IC50确定细胞的增殖和药物敏感性，并使用双荧光素酶报告实验来确定miRNA对ANGPTL4的调控。
结果：ANGPTL4在OSCC组织中较正常组织表达高。敲除ANGPTL4后，OSCC细胞增殖减少，对顺铂的敏感性增加。双荧光素酶报告实验显示，当过表达miR-29c-3p和miR-223-3p后，野生型（wild-type, WT）组的荧光强度减少，而突变型（mutant, MUT）组的荧光强度几乎没有变化。上述结果证明了miRNA的过表达降低了ANGPTL4的蛋白水平，从而影响OSCC细胞增殖和耐药性。
结论：miR-29c-3p和miR-223-3p可以通过靶向ANGPTL4来调控OSCC的细胞增殖和顺铂耐药性。
关键词：口腔鳞状细胞癌（OSCC）；微小RNA（microRNA, miRNA）；血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）；增殖；顺铂耐药性。
·前言
口腔癌（Oral cancer）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全球所有恶性肿瘤的1%～2%[1]。因为口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinom, OSCC）易于转移且预后不良，5年总生存率仅为55%[2]。顺铂（Cisplatin）是OSCC术后化疗的一线药物[3]，但OSCC对顺铂化疗的耐药性日益严重[4]。如何有效提高术后化疗的药物敏感性，是OSCC研究中的一个热点和难题。
近期研究表明血管生成样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）可能参与OSCC的发生，并与OSCC的转移相关[5]，同时ANGPTL4也可能是舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma ，TSCC）的重要标志物以及防止TSCC发展和转移的重要治疗靶点[6]。
本课题组前期研究表明，ANGPTL4的下调可以抑制TSCC的迁移和增殖，且ANGPTL4的高表达与TSCC的T分期、淋巴结转移、血管生成和较差的总生存期相关[7]。ANGPTL4基因位于19p131染色体上，包含7个外显子和6个内含子。目前认为，ANGPTL4家族的主要功能是参与物质和能量代谢的调节，但近期许多研究已证实，ANGPTL4在肿瘤进展中也起着重要的调控作用。此外，仍有研究表明ANGPTL4在肝癌和其他癌症中发挥抑癌作用[8]。ANGPTL4可能作为抑癌基因和致癌基因发挥双重功能，但其调节机制仍不清楚。因此，ANGPTL4在OSCC中的作用值得进一步探索。
微小RNA（MicroRNAs, miRNAs）是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们参与调节转录后基因表达。许多研究已经证明，miRNA的异常表达可以参与头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous carcinoma, HNSC）及其他癌症的发生、发展[9]。miRNA可以调节目标基因的表达水平，诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译。在本研究中，探索了ANGPTL4在OSCC中的表达水平及其变化的影响，验证miRNA对ANGPTL4的靶向调控，并确定miRNA对ANGPTL4的靶向调控是否对OSCC的增殖和耐药性存在影响。本研究将对OSCC的诊断、治疗以及预后预测提供一定的参考作用。按照MDAR报告清单呈现以下文章。（可在https://t.cn/A6YN3H95获取）
·方法
组织收集
本研究符合赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki, 2013年修订版）。该研究已得到中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准（No. SYSEC-KY-KS-2021-028）。从中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科获取了36对来自口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者的肿瘤组织（tumor tissues , T）和癌旁组织（paracancerous tissues, P）。所有患者均为原发OSCC，未接受过术前放疗或化疗。所有样本均存储在-80℃下备用。所有患者均已签署知情同意书。使用了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库来分析头颈鳞状细胞癌（HNSC）和正常组织中ANGPTL4的表达。
细胞培养和处理
购买了来自中国科学院（上海，中国）的HOK、SCC9、UM1、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞系，并使用上述细胞开展实验。所有细胞系均培养于含10％胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，美国）和1％青霉素-链霉素溶液（Thermo Fisher，美国）的DMEM（Thermo Fisher，美国）或DMEM-F12（Thermo Fisher，美国）所配完全培养基，温度37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中。其中HOK、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞培养使用DMEM，SCC9和UM1细胞培养使用F12/DMEM。
RNA提取和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
总RNA使用TRIzol试剂（TaKaRa，日本）提取，按照制造商说明，使用ABI 9700实时PCR仪（ABI，美国）反转录为cDNA。MicroRNA反转录引物按照茎环法[10]设计。1 µL的cDNA与TB Green® Premix Ex Taq™ II (#RR820B, TaKaRa, Japan）按照制造商的说明，在20 µL反应体积下混合。在Light Cycler 480 II实时PCR系统（Roche，瑞士）中测定mRNA的相对表达，使用统计软件进行统计分析。反应条件如下：94℃ 2 min，94℃ 20秒，58℃ 20秒，72℃ 20秒，共40循环，所有反应均重复3次。根据GAPDH和U6的表达进行标准化后，使用2−ΔΔCt方法计算ANGPTL4和microRNA的相对表达水平。如表S1所示，所有PCR引物均从IGEBIO（广州，中国）购买。
Western blot检测
为提取蛋白，将细胞用预冷PBS洗涤2次，刮取收集细胞，然后在含有1%蛋白酶抑制剂（#CW2200S，CWBIO，中国）的裂解缓冲液（#01408，Beyotime，中国）中裂解。离心后，收集上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒（#CW0014S，CWBIO，中国）确定蛋白浓度。稀释并混合上样缓冲液（#CW0027S，CWBIO，中国），并在95℃加热5 min使蛋白变性。按照Beyotime聚丙烯酰胺凝胶试剂盒的说明准备SDS-PAGE凝胶。电泳后（90 V，1.3 h），将蛋白转移到PVDF膜（#P0021S，Beyotime，中国）（250 mA，70 min）。将PVDF膜在含有5％脱脂牛奶和0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中孵育1 h，以封闭蛋白。将一抗ANGPTL4 (#18374-1-AP, Proteintech, USA）和GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, USA）在含有0.1％ Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白抗体稀释液中溶解，稀释比例为1:1000，然后在4℃摇床中孵育16 h（过夜孵育）。将膜在含有0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中洗涤。然后在含有0.1％Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白中，以1:1,000的稀释比例孵育二抗，包括山羊抗小鼠IgG-HRP (#sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, USA）和山羊抗兔IgG-HRP (#sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, USA)1 h。根据标准流程进行显色，拍照和凝胶图像分析。
更多方法请点击微信链接查看！
MiR-29c-3p和MiR-223-3p通过靶向ANGPTL4调控口腔鳞状细胞癌的增殖和耐药性
背景：本研究旨在确定血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）中的表达和功能，并探究miR-29C-3p和miR-223-3p是否可以通过靶向ANGPTL4调控OSCC的增殖和顺铂耐药性。
方法：首先在生物信息学数据库中预测肿瘤中ANGPTL4和microRNAs（miRNAs）的表达，随后通过Western blot和qPCR检测组织和细胞中ANGPTL4和miRNA的蛋白质、mRNA表达水平。通过平板克隆形成、CCK-8实验和IC50确定细胞的增殖和药物敏感性，并使用双荧光素酶报告实验来确定miRNA对ANGPTL4的调控。
结果：ANGPTL4在OSCC组织中较正常组织表达高。敲除ANGPTL4后，OSCC细胞增殖减少，对顺铂的敏感性增加。双荧光素酶报告实验显示，当过表达miR-29c-3p和miR-223-3p后，野生型（wild-type, WT）组的荧光强度减少，而突变型（mutant, MUT）组的荧光强度几乎没有变化。上述结果证明了miRNA的过表达降低了ANGPTL4的蛋白水平，从而影响OSCC细胞增殖和耐药性。
结论：miR-29c-3p和miR-223-3p可以通过靶向ANGPTL4来调控OSCC的细胞增殖和顺铂耐药性。
关键词：口腔鳞状细胞癌（OSCC）；微小RNA（microRNA, miRNA）；血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）；增殖；顺铂耐药性。
·前言
口腔癌（Oral cancer）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全球所有恶性肿瘤的1%～2%[1]。因为口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinom, OSCC）易于转移且预后不良，5年总生存率仅为55%[2]。顺铂（Cisplatin）是OSCC术后化疗的一线药物[3]，但OSCC对顺铂化疗的耐药性日益严重[4]。如何有效提高术后化疗的药物敏感性，是OSCC研究中的一个热点和难题。
近期研究表明血管生成样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）可能参与OSCC的发生，并与OSCC的转移相关[5]，同时ANGPTL4也可能是舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma ，TSCC）的重要标志物以及防止TSCC发展和转移的重要治疗靶点[6]。
本课题组前期研究表明，ANGPTL4的下调可以抑制TSCC的迁移和增殖，且ANGPTL4的高表达与TSCC的T分期、淋巴结转移、血管生成和较差的总生存期相关[7]。ANGPTL4基因位于19p131染色体上，包含7个外显子和6个内含子。目前认为，ANGPTL4家族的主要功能是参与物质和能量代谢的调节，但近期许多研究已证实，ANGPTL4在肿瘤进展中也起着重要的调控作用。此外，仍有研究表明ANGPTL4在肝癌和其他癌症中发挥抑癌作用[8]。ANGPTL4可能作为抑癌基因和致癌基因发挥双重功能，但其调节机制仍不清楚。因此，ANGPTL4在OSCC中的作用值得进一步探索。
微小RNA（MicroRNAs, miRNAs）是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们参与调节转录后基因表达。许多研究已经证明，miRNA的异常表达可以参与头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous carcinoma, HNSC）及其他癌症的发生、发展[9]。miRNA可以调节目标基因的表达水平，诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译。在本研究中，探索了ANGPTL4在OSCC中的表达水平及其变化的影响，验证miRNA对ANGPTL4的靶向调控，并确定miRNA对ANGPTL4的靶向调控是否对OSCC的增殖和耐药性存在影响。本研究将对OSCC的诊断、治疗以及预后预测提供一定的参考作用。按照MDAR报告清单呈现以下文章。（可在https://t.cn/A6YN3H95获取）
·方法
组织收集
本研究符合赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki, 2013年修订版）。该研究已得到中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准（No. SYSEC-KY-KS-2021-028）。从中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科获取了36对来自口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者的肿瘤组织（tumor tissues , T）和癌旁组织（paracancerous tissues, P）。所有患者均为原发OSCC，未接受过术前放疗或化疗。所有样本均存储在-80℃下备用。所有患者均已签署知情同意书。使用了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库来分析头颈鳞状细胞癌（HNSC）和正常组织中ANGPTL4的表达。
细胞培养和处理
购买了来自中国科学院（上海，中国）的HOK、SCC9、UM1、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞系，并使用上述细胞开展实验。所有细胞系均培养于含10％胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，美国）和1％青霉素-链霉素溶液（Thermo Fisher，美国）的DMEM（Thermo Fisher，美国）或DMEM-F12（Thermo Fisher，美国）所配完全培养基，温度37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中。其中HOK、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞培养使用DMEM，SCC9和UM1细胞培养使用F12/DMEM。
RNA提取和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
总RNA使用TRIzol试剂（TaKaRa，日本）提取，按照制造商说明，使用ABI 9700实时PCR仪（ABI，美国）反转录为cDNA。MicroRNA反转录引物按照茎环法[10]设计。1 µL的cDNA与TB Green® Premix Ex Taq™ II (#RR820B, TaKaRa, Japan）按照制造商的说明，在20 µL反应体积下混合。在Light Cycler 480 II实时PCR系统（Roche，瑞士）中测定mRNA的相对表达，使用统计软件进行统计分析。反应条件如下：94℃ 2 min，94℃ 20秒，58℃ 20秒，72℃ 20秒，共40循环，所有反应均重复3次。根据GAPDH和U6的表达进行标准化后，使用2−ΔΔCt方法计算ANGPTL4和microRNA的相对表达水平。如表S1所示，所有PCR引物均从IGEBIO（广州，中国）购买。
Western blot检测
为提取蛋白，将细胞用预冷PBS洗涤2次，刮取收集细胞，然后在含有1%蛋白酶抑制剂（#CW2200S，CWBIO，中国）的裂解缓冲液（#01408，Beyotime，中国）中裂解。离心后，收集上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒（#CW0014S，CWBIO，中国）确定蛋白浓度。稀释并混合上样缓冲液（#CW0027S，CWBIO，中国），并在95℃加热5 min使蛋白变性。按照Beyotime聚丙烯酰胺凝胶试剂盒的说明准备SDS-PAGE凝胶。电泳后（90 V，1.3 h），将蛋白转移到PVDF膜（#P0021S，Beyotime，中国）（250 mA，70 min）。将PVDF膜在含有5％脱脂牛奶和0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中孵育1 h，以封闭蛋白。将一抗ANGPTL4 (#18374-1-AP, Proteintech, USA）和GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, USA）在含有0.1％ Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白抗体稀释液中溶解，稀释比例为1:1000，然后在4℃摇床中孵育16 h（过夜孵育）。将膜在含有0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中洗涤。然后在含有0.1％Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白中，以1:1,000的稀释比例孵育二抗，包括山羊抗小鼠IgG-HRP (#sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, USA）和山羊抗兔IgG-HRP (#sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, USA)1 h。根据标准流程进行显色，拍照和凝胶图像分析。
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