原生质体的分离需要考虑材料的选择，材料的预处理，分离的方法及注意的环节
问题的提出：平时比较关心原生质体纯化、培养、和活力鉴定等，其实，原生质体的材料选择是有讲究的，材料还需要预处理，原生质体分离需要考虑渗透压偏大，轻度质壁分离为宜外，还需要考虑酶处理分离的方法中需要注意时间、浓度等，以防止损伤质膜，原因是什么呢？
1.材料的选择
由于供体材料的年龄、生理状态和生长环境等都可能影响原生质体的得率、质量以及以后的培养和再生，同时也影响实验的重复性，因此一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质体的材料。
叶片是最常用的材料，理由是取材方便，叶肉组织细胞排列疏松，酶液可以容易地到达细胞壁，从叶片中可以分离出大量的比较均一的原生质体，而且叶肉原生质体有叶绿体，为选择杂种细胞提供了天然的标记。
单子叶植物，特别是禾谷类植物的叶表面通常含有硅质，不易被酶液降解，因而常用疏松易碎的愈伤组织或悬浮培养的细胞制备原生质体。用愈伤组织或悬浮细胞制备原生质体时，细胞系建立时间的长短、继代培养的时间和培养基的成分等都影响原生质体分离的数量和质量。一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系分离原生质体效果较好。
对单子叶植物和大多数双子叶植物而言，采用颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织及由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。且在培养中容易得到持续的细胞分裂。
2.材料的预处理
在制备原生字体前，对供体材料进行预处理，往往有助于获得优质的原生质体。预处理的作用可能是改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度。也可能是改变细胞壁的化学成分，或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。
预处理的方法有暗处理一段时间；预培养一段时间；预萎蔫有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁而分离原生质体；预质壁分离可加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。
3.分离的方法及注意的环节
可以用机械法和酶解法，具体的方法可以参考链接：拓展｜原生质体如何分离？酶解法分离法酶有哪些种类？如何操作？
分离原生质体的酶溶液一般是由不同的酶制品、渗透稳定剂以及稳定质膜的药品组成，有时还在其中加入少量的缓冲剂或其他药品。酶制剂的种类和用量因材料和其酶活力高低不同而异。应该注意，任何酶制剂都不是绝对纯的，一般程度不同地都混有对原生色体不利的脂酶、蛋白酶甚至核酸酶，因此，使用酶制剂时应遵循的原则是，以用最少的梅制剂品种、最少的量，但能分离得到完整健康的原生质体为准。为防止粗酶制剂中杂酶对原生质体的不利影响，在有些情况下，使用之前需要对酶进行纯化。
原生质体分离时，细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于内外渗透压不同的情况下，就可能吸水、胀破或失水皱缩。因此，在酶液中必须加渗透稳定剂，以保护原生质体的活力和质膜的稳定性。一般以使细胞发生轻度的质壁分离为宜。
3.典型试题
试题1：下列关于原生质体及其制备的叙述，错误的是( )
A．用纤维素酶和果胶酶能降解植物细胞壁，体现了酶的专一性
B．失去细胞壁的原生质体呈现出球形，体现了细胞壁维持细胞形态的作用
C．细胞壁具有全透性，与细胞的选择透过性无关
D．在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液中，原生质体会因吸水发生适度膨胀
解析：在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液中，原生质体会因失水发生轻微的质壁分离，D错误。故答案为D。
试题2：下列关于制备原生质体的叙述，正确的是( )
A．经纤维素酶和胰蛋白酶降解细胞壁获得的原生质体已经失去了生理活性
B．降解细胞壁之前要用0.5～0.6 mol/L的甘露醇等低渗溶液处理植物细胞
C．处理的植物细胞可以是根尖、愈伤组织或悬浮培养细胞，但不能是叶片细胞
D．充足光照下，菠菜叶肉细胞制备的原生质体中可以观察到叶绿体和胞质环流
解析：制备原生质体所用的酶为纤维素酶和果胶酶，获得的原生质体仍然具有生理活性，A错误；降解细胞壁之前要用0.5～0.6 mol/L的甘露醇等高渗溶液处理植物细胞，B错误；处理的植物细胞可以是根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，C错误。故答案为D。
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问题的提出：平时比较关心原生质体纯化、培养、和活力鉴定等，其实，原生质体的材料选择是有讲究的，材料还需要预处理，原生质体分离需要考虑渗透压偏大，轻度质壁分离为宜外，还需要考虑酶处理分离的方法中需要注意时间、浓度等，以防止损伤质膜，原因是什么呢？
1.材料的选择
由于供体材料的年龄、生理状态和生长环境等都可能影响原生质体的得率、质量以及以后的培养和再生，同时也影响实验的重复性，因此一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质体的材料。
叶片是最常用的材料，理由是取材方便，叶肉组织细胞排列疏松，酶液可以容易地到达细胞壁，从叶片中可以分离出大量的比较均一的原生质体，而且叶肉原生质体有叶绿体，为选择杂种细胞提供了天然的标记。
单子叶植物，特别是禾谷类植物的叶表面通常含有硅质，不易被酶液降解，因而常用疏松易碎的愈伤组织或悬浮培养的细胞制备原生质体。用愈伤组织或悬浮细胞制备原生质体时，细胞系建立时间的长短、继代培养的时间和培养基的成分等都影响原生质体分离的数量和质量。一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系分离原生质体效果较好。
对单子叶植物和大多数双子叶植物而言，采用颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织及由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。且在培养中容易得到持续的细胞分裂。
2.材料的预处理
在制备原生字体前，对供体材料进行预处理，往往有助于获得优质的原生质体。预处理的作用可能是改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度。也可能是改变细胞壁的化学成分，或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。
预处理的方法有暗处理一段时间；预培养一段时间；预萎蔫有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁而分离原生质体；预质壁分离可加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。
3.分离的方法及注意的环节
可以用机械法和酶解法，具体的方法可以参考链接：拓展｜原生质体如何分离？酶解法分离法酶有哪些种类？如何操作？
分离原生质体的酶溶液一般是由不同的酶制品、渗透稳定剂以及稳定质膜的药品组成，有时还在其中加入少量的缓冲剂或其他药品。酶制剂的种类和用量因材料和其酶活力高低不同而异。应该注意，任何酶制剂都不是绝对纯的，一般程度不同地都混有对原生色体不利的脂酶、蛋白酶甚至核酸酶，因此，使用酶制剂时应遵循的原则是，以用最少的梅制剂品种、最少的量，但能分离得到完整健康的原生质体为准。为防止粗酶制剂中杂酶对原生质体的不利影响，在有些情况下，使用之前需要对酶进行纯化。
原生质体分离时，细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于内外渗透压不同的情况下，就可能吸水、胀破或失水皱缩。因此，在酶液中必须加渗透稳定剂，以保护原生质体的活力和质膜的稳定性。一般以使细胞发生轻度的质壁分离为宜。
3.典型试题
试题1：下列关于原生质体及其制备的叙述，错误的是( )
A．用纤维素酶和果胶酶能降解植物细胞壁，体现了酶的专一性
B．失去细胞壁的原生质体呈现出球形，体现了细胞壁维持细胞形态的作用
C．细胞壁具有全透性，与细胞的选择透过性无关
D．在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液中，原生质体会因吸水发生适度膨胀
解析：在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液中，原生质体会因失水发生轻微的质壁分离，D错误。故答案为D。
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D．充足光照下，菠菜叶肉细胞制备的原生质体中可以观察到叶绿体和胞质环流
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