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‼书名：《颜楚虞宋折意》
‼主角：颜楚虞，宋折意
以下章节非原文：
骊山北构而西折，直走咸阳盖二客不能从焉予亦悄然而悲，肃然而恐，凛乎其不可留也老当益壮，宁移白首之心？穷且益坚，不坠青云之志一旦不能有，输来其间一旦不能有，输来其间虽趣舍万殊，静躁不同，当其欣于所遇，暂得于己，快然自足，不知老之将至；及其所之既倦，情随事迁，感慨系之矣
苏子愀然，正襟危坐而问客曰：“何为其然也？”客曰：“月明星稀，乌鹊南飞，此非曹孟德之诗乎？西望夏口，东望武昌，山川相缪，郁乎苍苍，此非孟德之困于周郎者乎？方其破荆州，下江陵，顺流而东也，舳舻千里，旌旗蔽空，酾酒临江，横槊赋诗，固一世之雄也，而今安在哉？况吾与子渔樵于江渚之上，侣鱼虾而友麋鹿，驾一叶之扁舟，举匏樽以相属无路请缨，等终军之弱冠；有怀投笔，慕宗悫之长风杨意不逢，抚凌云而自惜；钟期既遇，奏流水以何惭？
呜乎！胜地不常，盛筵难再；兰亭已矣，梓泽丘墟“你爸妈要是知道了，得抽死你！”我提醒她。 “嗯，你也不会再接受我，不是吗？”宋折意苦笑了一声，“如果陶雪没有回来，又或者我和她之间没有孩子，我想还有点机会。” 第115章 这一天，我都在家里没出过门，因为接近年底，宋折意通知我直接明年开年再去上班，这段时间就在家里好好休息，工资照算。 我又问：你和颜楚虞还好吗？怎么朋友圈的背景照片都换了？ “所以你的答案是不帮我。”宋折意直接了当地打断了我的话。 “是吗？”宋折意沉默了几秒，接着说，“前段时间我和颜楚虞有过联系，她还没有彻底接受你丈夫，但是她说他们之间已经坦诚地谈过了很多事，其中应该包括你，我没想到她有一天会成为小三。” 李耀恒似乎一下子酒醒了，懵逼地看着脸色可怕的宋折意，“裴总，你这是干什么？” 舅妈却毫不留情，“不谈，你妈那时候怎么对我们的？她胳膊肘向外拐时，怎么没想到会有今天？” “我知道，但是如果你心里还恨他，可以利用我。”宋折意的话，越来越让我震惊。 宋折意紧随其后出现，他似乎心情很差，眼神扫过来时，有股烦躁的感觉。 谁得到的玫瑰最多，就是今晚的人气女神。 李悠笑眯眯地看着，然后问我，“曦曦，你上去跳一个呗？” 我放下指甲钳，拿起手机走到了院子里去。 我根本没有再想着宋折意，只是觉得错过了他那样的男人，有些可惜罢了。 “有司机，走吧。”宋折意却不理会我的拒绝，他伸手拿过我桌子上的手机，转身就走。 故意让你未来岳母见证我们秀恩爱的事，给你追求真爱的路上放绊脚石的事。 我和颜楚虞不一样，我因为身体原因，这几年大姨妈压根不准时，所以这两个大姨妈缺席，我并没有放在心上。
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‼书名：《颜楚虞宋折意》
‼主角：颜楚虞，宋折意
以下章节非原文：
骊山北构而西折，直走咸阳盖二客不能从焉予亦悄然而悲，肃然而恐，凛乎其不可留也老当益壮，宁移白首之心？穷且益坚，不坠青云之志一旦不能有，输来其间一旦不能有，输来其间虽趣舍万殊，静躁不同，当其欣于所遇，暂得于己，快然自足，不知老之将至；及其所之既倦，情随事迁，感慨系之矣
苏子愀然，正襟危坐而问客曰：“何为其然也？”客曰：“月明星稀，乌鹊南飞，此非曹孟德之诗乎？西望夏口，东望武昌，山川相缪，郁乎苍苍，此非孟德之困于周郎者乎？方其破荆州，下江陵，顺流而东也，舳舻千里，旌旗蔽空，酾酒临江，横槊赋诗，固一世之雄也，而今安在哉？况吾与子渔樵于江渚之上，侣鱼虾而友麋鹿，驾一叶之扁舟，举匏樽以相属无路请缨，等终军之弱冠；有怀投笔，慕宗悫之长风杨意不逢，抚凌云而自惜；钟期既遇，奏流水以何惭？
呜乎！胜地不常，盛筵难再；兰亭已矣，梓泽丘墟“你爸妈要是知道了，得抽死你！”我提醒她。 “嗯，你也不会再接受我，不是吗？”宋折意苦笑了一声，“如果陶雪没有回来，又或者我和她之间没有孩子，我想还有点机会。” 第115章 这一天，我都在家里没出过门，因为接近年底，宋折意通知我直接明年开年再去上班，这段时间就在家里好好休息，工资照算。 我又问：你和颜楚虞还好吗？怎么朋友圈的背景照片都换了？ “所以你的答案是不帮我。”宋折意直接了当地打断了我的话。 “是吗？”宋折意沉默了几秒，接着说，“前段时间我和颜楚虞有过联系，她还没有彻底接受你丈夫，但是她说他们之间已经坦诚地谈过了很多事，其中应该包括你，我没想到她有一天会成为小三。” 李耀恒似乎一下子酒醒了，懵逼地看着脸色可怕的宋折意，“裴总，你这是干什么？” 舅妈却毫不留情，“不谈，你妈那时候怎么对我们的？她胳膊肘向外拐时，怎么没想到会有今天？” “我知道，但是如果你心里还恨他，可以利用我。”宋折意的话，越来越让我震惊。 宋折意紧随其后出现，他似乎心情很差，眼神扫过来时，有股烦躁的感觉。 谁得到的玫瑰最多，就是今晚的人气女神。 李悠笑眯眯地看着，然后问我，“曦曦，你上去跳一个呗？” 我放下指甲钳，拿起手机走到了院子里去。 我根本没有再想着宋折意，只是觉得错过了他那样的男人，有些可惜罢了。 “有司机，走吧。”宋折意却不理会我的拒绝，他伸手拿过我桌子上的手机，转身就走。 故意让你未来岳母见证我们秀恩爱的事，给你追求真爱的路上放绊脚石的事。 我和颜楚虞不一样，我因为身体原因，这几年大姨妈压根不准时，所以这两个大姨妈缺席，我并没有放在心上。
SSR分子标记实验操作及其注意事项
#生物试剂#
SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。
一、试剂配制
1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。
2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）
3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。
4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。
5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。
6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。
7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。
8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。
9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。
10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。
11.显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。
二：DNA提取过程中的注意事项
(1) 避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠球最好是一次性的，如果是反复使用的小钢珠球，必须彻底清洗干净使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。
(2) 试验材料应选取幼嫩组织，因为植物幼嫩组织DNA含量高，且多糖多酚含量少。
(3) 装入离心管的叶片组织最好不要超过离心管的1/3-1/2，否则会引起细胞裂解不完全，导致产量和纯度下降。
(4) 使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使样品磨成粉末状。
(5) 水浴前需要确保试管盖盖严，或使用辅助工具进行加固，以防止水浴时因温度较高导致试管盖开裂。
(6) 水浴过程中，每隔10-15min将离心管取出振荡摇匀，使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接触，破坏细胞结构，释放DNA。
(7) 实验过程中振荡动作不宜剧烈，移液枪头最好使用大孔枪头，移液动作不能太快，以免使DNA断裂。
(8) 当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后，倾倒离心管中多余液体时，应避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液体后，改用吸水纸吸取剩余液体。
(9) DNA风干最好在无菌操作台上进行，待乙醇彻底风干后才能加入TE或ddH2O溶解，如果有残留的乙醇，可能会影响PCR反应的试验结果。
(10) 如果DNA纯度不好，可将粗提物用溶液1×TE充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。
三：实验步骤
1、玻璃板清洗：
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。
2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。
3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。
4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）
Urea－TBE51ml
40%丙烯酰胺 9ml
10%APS 400μl
TEMED30μl
共计约60ml
2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。
4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。
3、凝胶电泳
1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。
2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。
7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。
4、银染
1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
3）用自来水（最好用双蒸水）短时间（5-10s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）将凝胶浸在显影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，显影20-30min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）用自来水（最好用双蒸水）冲洗凝胶两遍，每次2min。
6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以永久保存，也可以进行拍照记录。
四、PCR反应
1、模板及引物配制
1）模板DNA：使用25ng/μl的DNA作为模板。
2）引物：母液250M，取10μl的母液加水至100μl即得到25μM的引物。
2、DNA片段扩增：
取2uL烯释的模板DNA(25ng/uL)加入18uL如下的反应液：
H2O 13.5
10×buffer 2
dNTPs(10mM) 0.4
引物Ⅰ(25uM) 0.4
引物Ⅱ(25uM) 0.4
MgCL2(1.5mM)1.2
Taq酶(5U/uL) 0.1
Total18
混合后按如下PCR程序扩增：
Step195℃ 9M；
Step294℃ 50S；
Step3退火温度 45S；
Step472℃ 90S；
Srep5 Go to Step2，repeat 27 cycles；
Step672℃ 7M。
扩增后的样品中加入3/4体积的Loading Buffer，混合，95℃变性，待用。
五：PCR 反应实验操作注意事项
PCR 反应过程中应特别注意不要使样品相互污染， 以免造成试验结果不准确， 同时也要注意所加试剂或样品必须是经过混匀后的液体， 这样才能保证反应液各成分的浓度和体积的均一性 所用试剂需从正规商家购进， 以保证试剂的质量。
( 1) 尽量使用一次性手套 专用整套移液器 成套试剂和其他必需品， 避免外来 DNA 污染反应体系( 2) DNA 模板应稀释为适宜的浓度， 使加入 PCR反应的 DNA 样品体积最好在 4 ～ 5 l 如果 DNA 模板样品量太少， 仅有1 ～ 2 l， 不仅实验操作难度大， 而且如果操作时间长， 会导致 DNA 反应液部分或全部蒸发掉， 影响 PCR 反应结果。
( 3) 可以先将 DNA 样品加到 PCR 管底部， 再加其他 PCR 反应混合液 加样时选择不同的方位加 DNA模板和其他 PCR 反应混合液， 这样枪头靠壁加样时不会交叉污染。
( 4) 加样完毕后， 盖上盖子， 混匀反应液， 再低速离心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即进行 PCR 扩增， 需将 PCR 反应混合液置于 － 20 ℃保存备用。
( 5) PCR 扩增反应使用的酶不能长时间放置于室温下， 须随用随取， 使用完毕后立即放回 － 20 ℃冰箱否则， 酶易失活。
( 6) PCR 反应的退火温度应根据不同的引物来确定最佳退火温度， 以确保扩增的条带中杂带少， 目标带明显， 引物退火温度一般按照 Tm = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式计算。
#生物试剂#
SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。
一、试剂配制
1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。
2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）
3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。
4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。
5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。
6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。
7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。
8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。
9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。
10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。
11.显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。
二：DNA提取过程中的注意事项
(1) 避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠球最好是一次性的，如果是反复使用的小钢珠球，必须彻底清洗干净使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。
(2) 试验材料应选取幼嫩组织，因为植物幼嫩组织DNA含量高，且多糖多酚含量少。
(3) 装入离心管的叶片组织最好不要超过离心管的1/3-1/2，否则会引起细胞裂解不完全，导致产量和纯度下降。
(4) 使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使样品磨成粉末状。
(5) 水浴前需要确保试管盖盖严，或使用辅助工具进行加固，以防止水浴时因温度较高导致试管盖开裂。
(6) 水浴过程中，每隔10-15min将离心管取出振荡摇匀，使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接触，破坏细胞结构，释放DNA。
(7) 实验过程中振荡动作不宜剧烈，移液枪头最好使用大孔枪头，移液动作不能太快，以免使DNA断裂。
(8) 当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后，倾倒离心管中多余液体时，应避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液体后，改用吸水纸吸取剩余液体。
(9) DNA风干最好在无菌操作台上进行，待乙醇彻底风干后才能加入TE或ddH2O溶解，如果有残留的乙醇，可能会影响PCR反应的试验结果。
(10) 如果DNA纯度不好，可将粗提物用溶液1×TE充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。
三：实验步骤
1、玻璃板清洗：
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。
2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。
3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。
4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）
Urea－TBE51ml
40%丙烯酰胺 9ml
10%APS 400μl
TEMED30μl
共计约60ml
2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。
4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。
3、凝胶电泳
1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。
2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。
7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。
4、银染
1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
3）用自来水（最好用双蒸水）短时间（5-10s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）将凝胶浸在显影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，显影20-30min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）用自来水（最好用双蒸水）冲洗凝胶两遍，每次2min。
6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以永久保存，也可以进行拍照记录。
四、PCR反应
1、模板及引物配制
1）模板DNA：使用25ng/μl的DNA作为模板。
2）引物：母液250M，取10μl的母液加水至100μl即得到25μM的引物。
2、DNA片段扩增：
取2uL烯释的模板DNA(25ng/uL)加入18uL如下的反应液：
H2O 13.5
10×buffer 2
dNTPs(10mM) 0.4
引物Ⅰ(25uM) 0.4
引物Ⅱ(25uM) 0.4
MgCL2(1.5mM)1.2
Taq酶(5U/uL) 0.1
Total18
混合后按如下PCR程序扩增：
Step195℃ 9M；
Step294℃ 50S；
Step3退火温度 45S；
Step472℃ 90S；
Srep5 Go to Step2，repeat 27 cycles；
Step672℃ 7M。
扩增后的样品中加入3/4体积的Loading Buffer，混合，95℃变性，待用。
五：PCR 反应实验操作注意事项
PCR 反应过程中应特别注意不要使样品相互污染， 以免造成试验结果不准确， 同时也要注意所加试剂或样品必须是经过混匀后的液体， 这样才能保证反应液各成分的浓度和体积的均一性 所用试剂需从正规商家购进， 以保证试剂的质量。
( 1) 尽量使用一次性手套 专用整套移液器 成套试剂和其他必需品， 避免外来 DNA 污染反应体系( 2) DNA 模板应稀释为适宜的浓度， 使加入 PCR反应的 DNA 样品体积最好在 4 ～ 5 l 如果 DNA 模板样品量太少， 仅有1 ～ 2 l， 不仅实验操作难度大， 而且如果操作时间长， 会导致 DNA 反应液部分或全部蒸发掉， 影响 PCR 反应结果。
( 3) 可以先将 DNA 样品加到 PCR 管底部， 再加其他 PCR 反应混合液 加样时选择不同的方位加 DNA模板和其他 PCR 反应混合液， 这样枪头靠壁加样时不会交叉污染。
( 4) 加样完毕后， 盖上盖子， 混匀反应液， 再低速离心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即进行 PCR 扩增， 需将 PCR 反应混合液置于 － 20 ℃保存备用。
( 5) PCR 扩增反应使用的酶不能长时间放置于室温下， 须随用随取， 使用完毕后立即放回 － 20 ℃冰箱否则， 酶易失活。
( 6) PCR 反应的退火温度应根据不同的引物来确定最佳退火温度， 以确保扩增的条带中杂带少， 目标带明显， 引物退火温度一般按照 Tm = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式计算。
植物奶PK：燕麦奶、豆奶、杏仁奶、椰奶，哪个最值得喝？
植物奶总体营养价值不如牛奶，但可以通过人为添加补足。
常见植物奶中：
豆奶一般蛋白质含量高，含有少量大豆异黄酮；
燕麦奶的特点是有一定的膳食纤维（包括β-葡聚糖）；
杏仁奶如果不加糖的话一般热量较低；
而椰奶则是植物奶“叛徒”，饱和脂肪酸可能比牛奶还高。
这些年植物奶悄悄地火了起来，有人喜欢植物奶是因为好喝(比如椰奶)，有人是因为乳糖不耐受，有人是从环保角度考虑，也有人是看重植物奶所代表的新潮的生活方式。今天从营养角度说说植物奶。#微博健康公开课##这个问题吃什么#
植物奶是什么
植物奶这个“奶”字并不代表其中加了牛奶，只是一种显示和牛奶对标、模仿和代替牛奶的意思，更准确点可以叫“植物蛋白饮料”，就是用谷物、坚果、豆类等打成浆为主要原料的产品，其实也不算什么新鲜事物，以前大家熟悉的杏仁露、豆浆等等都可以算，不过现在的产品比以前更加注重营养强化和健康效应了。
植物奶的先天营养价值总体上不如牛奶
单从植物原料看，植物奶的营养素含量通常比不上牛奶。
植物奶劣势
牛奶是蛋白质和微量营养素的好来源，牛奶中的蛋白质是优质蛋白，钙含量不仅较高而且人体吸收率也高。市面上的纯牛奶产品每100毫升蛋白质含量从3克到接近4克都有，钙含量大概每100毫升105-125毫克都有，而大多数植物奶的蛋白质含量大幅低于牛奶，不强化的钙含量很低，即使强化过了，钙的吸收率一般也比牛奶低。
植物奶优势
植物奶相比于牛奶，最确定的优点，就是除椰子奶外，其余植物奶的饱和脂肪酸含量都比牛奶低。
牛奶的脂肪中大约70%是饱和脂肪酸，100毫升的普通全脂牛奶，总脂肪含量大概3.25克，饱和脂肪酸大概2.27克，而一些优质的全脂纯牛奶产品脂肪含量高达每100毫升4.6克，那就是3.22克饱和脂肪酸。而豆奶、燕麦奶产品每100毫升的饱和脂肪酸大多数不到1克。
世界卫生组织建议成人和儿童把饱和脂肪酸的供能比控制在10%以内。对于普遍奶制品消费量很大的西方人群，因牛奶摄入量过大带来的饱和脂肪酸摄入过多可以成为一个健康风险，而植物奶在这方面就有优势了。
同时，由于植物性食材不含胆固醇，植物奶自然也不含胆固醇。
再者，植物奶会含有一些牛奶中没有的植物成分，比如膳食纤维、植物甾醇等等，这些成分对人体健康有一定潜在益处。
先天不足，后天来凑
尽管植物奶原料先天的营养价值比不上牛奶，但可以人为添加，像蛋白质、钙、维生素D等可以通过添加来强化，还可以添加一些能提高钙的吸收率的辅助成分。
此外植物奶还可以应用精准的酶解、发酵等工艺手段去除原料中的一些影响消化吸收的成分，改善口感和质地。
有些植物奶产品还会添加一些功能性成分，以期达到某种健康效果。
所以一款植物奶产品最终的营养成分构成还是得看实际的配方
不少产品确实把钙强化到了超过牛奶的水平，但同时，经过调配后，产品热量也未必比牛奶低。
下面看看具体的几种植物奶不同的特点。
豆奶
大多数叫“豆奶”的产品是指用黄豆为主要原料制作的。如果不考虑后期添加的问题，单从原料来说，豆奶一般是各种植物奶中蛋白质含量最高的。
根据国标《植物蛋白饮料 豆奶和豆奶饮料》（GB/T 30885-2014），最浓的一类豆奶“浓浆豆奶”的蛋白质含量达到每100毫升里3.2克以上，基本和牛奶相当。并且大豆蛋白本身属于优质蛋白，吸收利用率高，因此豆奶，尤其是浓缩型的，算是饮品中一种比较好的蛋白质来源。
此外黄豆原料中还含有比较丰富的B族维生素和钾，豆奶中也有。
特别优势
豆奶的特别优势在于其中含有大豆异黄酮，不过，具体含多少因产品而异，还得具体看，一般大约每100毫升大概含有10-30毫克的大豆异黄酮。
目前积累了不少研究证据支持，长期通过饮食摄入大豆异黄酮可显著降低女性乳腺癌发生风险，改善围绝经期综合征和绝经女性骨质疏松症，且有助于防治心血管疾病。
不过《中国居民膳食营养素参考摄入量（2023版中）》中把绝经前女性摄入大豆异黄酮降低乳腺癌发生风险的特定建议值（SPL）定为每天55mg，把已绝经女性摄入大豆异黄酮降低乳腺癌发生风险、改善围绝经期综合征和绝经后骨质疏松症的特定建议值（SPL）定为每天75mg，这样的量靠喝一点豆奶产品是达不到的，更多还是要来自食用豆制品。
嘌呤多吗？
有的朋友会担心豆奶嘌呤高，其实和水混合后研磨、过滤后所得到的豆浆本身相比于原料黄豆中的嘌呤已经下降了不少，同时很多豆奶产品不是纯豆浆，还配合了其他成分，总体来说豆奶的嘌呤含量不会很高。痛风患者在急性发作期还是要注意，而其他情况下，如果嘌呤控制得比较好，那适量饮用是可以的。
总体来说没添加太多糖的豆奶算是有营养且健康的饮料，市面上卖的比较火的几种豆奶大致数据看图。
燕麦奶
燕麦奶的蛋白质含量比不上豆奶，跟牛奶差距大，而碳水化合物含量一般比牛奶略高，它的特点在于含有一定的膳食纤维。
特别优势
燕麦本身含有丰富的膳食纤维，尤其是其中的β-葡聚糖，作为一种可溶性膳食纤维可以与胆汁酸结合，目前已有多项高质量证据证实燕麦β-葡聚糖具有一定降低血胆固醇水平的作用，对临床试验的荟萃分析显示，每天3g的燕麦β-葡聚糖分别使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇降低了0.3mmol/L和0.25mmol/L [1]。
不过实际燕麦奶产品中的膳食纤维含量并没有那么惊艳，大多数每100毫升中不足1g，只有少数产品达到1.5g左右，其中的β-葡聚糖具体有多少也不得而知。
燕麦奶是碳水炸弹？
燕麦毕竟是一种主食食物，原料本身含有很多碳水化合物，因此相比于不加糖的豆奶，燕麦奶的碳水化合物含量确实高些。但是这些来自燕麦本身的碳水化合物并非精制糖，而且经过稀释调配后也低了不少，叫“碳水炸弹”太夸张。
市面上常看到的几种燕麦奶数据看图。
杏仁奶
杏仁奶(注意不是巴旦木奶)通常蛋白质含量不如豆奶，碳水化合物含量也很低（不加糖的话），脂肪含量也不高，整体热量低（但还要具体产品是否浓缩了或者加糖了）。
杏仁奶含有一定的维生素E，其他方面也没什么值得一说的健康优势。
椰奶
椰奶可以算植物奶中的“叛徒”了，饱和脂肪酸含量有可能比牛奶更高。
首先要区分“椰子水”和“椰肉汁”的不同含义。“椰子水”指的是一个椰子中间的天然空心里的清澈像水的液体，椰子水热量低，糖分少，也不含多少脂肪。
“椰肉汁”则是把贴在椰子硬壳内的白色的椰肉破碎榨汁。由于椰肉有高达33%的脂肪含量，而这些脂肪里高达80%是饱和脂肪酸，因此椰肉汁不仅脂肪含量高，饱和脂肪酸含量也高。
叫“椰奶”、“椰乳”的产品多数以椰肉汁为主要原料，加了水，有的还加了糖。如果你留意一下营养成分表，会发现这类产品有的脂肪含量有的能达到17%-20%，有的「浓椰浆」甚至接近25%，light款也接近10%，这样大量摄入饱和脂肪，肯定算不上健康饮料。
不过由于没有具体标准，这类产品配方也是五花八门，也有椰肉汁、椰子水、水混起来的，这种就脂肪含量较低，具体看营养成分表挑选。
而且椰奶类产品也多半不能带来多少蛋白质和其他营养，普遍加了大量糖，总体来说不怎么推荐。
随着生椰拿铁的流行，有商家推出了「厚椰乳」用来搭配咖啡，这种产品也并没有具体的标准，常见的几款是椰肉汁＋白砂糖＋椰子水＋乳化剂＋盐等构成的，拿来配咖啡喝肯定不如只加纯牛奶、不放糖健康。
哪些人适合植物奶？
有非常严重的乳糖不耐、素食主义、对牛奶过敏等人群可以尝试尝试植物奶，比如像我有乳糖不耐受，喝一杯超大杯拿铁的话必然会腹泻，所以我很多时候会点燕麦拿铁。
不过总体上能喝牛奶的人群还是不建议彻底放弃牛奶的丰富营养价值和优秀的钙吸收率，不同植物奶产品的实际营养价值差距也是比较大的，购买时记得具体查看营养成分表。
参考资料：
[1] Whitehead A, Beck EJ, Tosh S, Wolever TM. Cholesterol-lowering effects of oat β-glucan: a meta-analysis of randomized controlled trials. Am J Clin Nutr. 2014 Dec;100(6):1413-21.
植物奶总体营养价值不如牛奶，但可以通过人为添加补足。
常见植物奶中：
豆奶一般蛋白质含量高，含有少量大豆异黄酮；
燕麦奶的特点是有一定的膳食纤维（包括β-葡聚糖）；
杏仁奶如果不加糖的话一般热量较低；
而椰奶则是植物奶“叛徒”，饱和脂肪酸可能比牛奶还高。
这些年植物奶悄悄地火了起来，有人喜欢植物奶是因为好喝(比如椰奶)，有人是因为乳糖不耐受，有人是从环保角度考虑，也有人是看重植物奶所代表的新潮的生活方式。今天从营养角度说说植物奶。#微博健康公开课##这个问题吃什么#
植物奶是什么
植物奶这个“奶”字并不代表其中加了牛奶，只是一种显示和牛奶对标、模仿和代替牛奶的意思，更准确点可以叫“植物蛋白饮料”，就是用谷物、坚果、豆类等打成浆为主要原料的产品，其实也不算什么新鲜事物，以前大家熟悉的杏仁露、豆浆等等都可以算，不过现在的产品比以前更加注重营养强化和健康效应了。
植物奶的先天营养价值总体上不如牛奶
单从植物原料看，植物奶的营养素含量通常比不上牛奶。
植物奶劣势
牛奶是蛋白质和微量营养素的好来源，牛奶中的蛋白质是优质蛋白，钙含量不仅较高而且人体吸收率也高。市面上的纯牛奶产品每100毫升蛋白质含量从3克到接近4克都有，钙含量大概每100毫升105-125毫克都有，而大多数植物奶的蛋白质含量大幅低于牛奶，不强化的钙含量很低，即使强化过了，钙的吸收率一般也比牛奶低。
植物奶优势
植物奶相比于牛奶，最确定的优点，就是除椰子奶外，其余植物奶的饱和脂肪酸含量都比牛奶低。
牛奶的脂肪中大约70%是饱和脂肪酸，100毫升的普通全脂牛奶，总脂肪含量大概3.25克，饱和脂肪酸大概2.27克，而一些优质的全脂纯牛奶产品脂肪含量高达每100毫升4.6克，那就是3.22克饱和脂肪酸。而豆奶、燕麦奶产品每100毫升的饱和脂肪酸大多数不到1克。
世界卫生组织建议成人和儿童把饱和脂肪酸的供能比控制在10%以内。对于普遍奶制品消费量很大的西方人群，因牛奶摄入量过大带来的饱和脂肪酸摄入过多可以成为一个健康风险，而植物奶在这方面就有优势了。
同时，由于植物性食材不含胆固醇，植物奶自然也不含胆固醇。
再者，植物奶会含有一些牛奶中没有的植物成分，比如膳食纤维、植物甾醇等等，这些成分对人体健康有一定潜在益处。
先天不足，后天来凑
尽管植物奶原料先天的营养价值比不上牛奶，但可以人为添加，像蛋白质、钙、维生素D等可以通过添加来强化，还可以添加一些能提高钙的吸收率的辅助成分。
此外植物奶还可以应用精准的酶解、发酵等工艺手段去除原料中的一些影响消化吸收的成分，改善口感和质地。
有些植物奶产品还会添加一些功能性成分，以期达到某种健康效果。
所以一款植物奶产品最终的营养成分构成还是得看实际的配方
不少产品确实把钙强化到了超过牛奶的水平，但同时，经过调配后，产品热量也未必比牛奶低。
下面看看具体的几种植物奶不同的特点。
豆奶
大多数叫“豆奶”的产品是指用黄豆为主要原料制作的。如果不考虑后期添加的问题，单从原料来说，豆奶一般是各种植物奶中蛋白质含量最高的。
根据国标《植物蛋白饮料 豆奶和豆奶饮料》（GB/T 30885-2014），最浓的一类豆奶“浓浆豆奶”的蛋白质含量达到每100毫升里3.2克以上，基本和牛奶相当。并且大豆蛋白本身属于优质蛋白，吸收利用率高，因此豆奶，尤其是浓缩型的，算是饮品中一种比较好的蛋白质来源。
此外黄豆原料中还含有比较丰富的B族维生素和钾，豆奶中也有。
特别优势
豆奶的特别优势在于其中含有大豆异黄酮，不过，具体含多少因产品而异，还得具体看，一般大约每100毫升大概含有10-30毫克的大豆异黄酮。
目前积累了不少研究证据支持，长期通过饮食摄入大豆异黄酮可显著降低女性乳腺癌发生风险，改善围绝经期综合征和绝经女性骨质疏松症，且有助于防治心血管疾病。
不过《中国居民膳食营养素参考摄入量（2023版中）》中把绝经前女性摄入大豆异黄酮降低乳腺癌发生风险的特定建议值（SPL）定为每天55mg，把已绝经女性摄入大豆异黄酮降低乳腺癌发生风险、改善围绝经期综合征和绝经后骨质疏松症的特定建议值（SPL）定为每天75mg，这样的量靠喝一点豆奶产品是达不到的，更多还是要来自食用豆制品。
嘌呤多吗？
有的朋友会担心豆奶嘌呤高，其实和水混合后研磨、过滤后所得到的豆浆本身相比于原料黄豆中的嘌呤已经下降了不少，同时很多豆奶产品不是纯豆浆，还配合了其他成分，总体来说豆奶的嘌呤含量不会很高。痛风患者在急性发作期还是要注意，而其他情况下，如果嘌呤控制得比较好，那适量饮用是可以的。
总体来说没添加太多糖的豆奶算是有营养且健康的饮料，市面上卖的比较火的几种豆奶大致数据看图。
燕麦奶
燕麦奶的蛋白质含量比不上豆奶，跟牛奶差距大，而碳水化合物含量一般比牛奶略高，它的特点在于含有一定的膳食纤维。
特别优势
燕麦本身含有丰富的膳食纤维，尤其是其中的β-葡聚糖，作为一种可溶性膳食纤维可以与胆汁酸结合，目前已有多项高质量证据证实燕麦β-葡聚糖具有一定降低血胆固醇水平的作用，对临床试验的荟萃分析显示，每天3g的燕麦β-葡聚糖分别使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇降低了0.3mmol/L和0.25mmol/L [1]。
不过实际燕麦奶产品中的膳食纤维含量并没有那么惊艳，大多数每100毫升中不足1g，只有少数产品达到1.5g左右，其中的β-葡聚糖具体有多少也不得而知。
燕麦奶是碳水炸弹？
燕麦毕竟是一种主食食物，原料本身含有很多碳水化合物，因此相比于不加糖的豆奶，燕麦奶的碳水化合物含量确实高些。但是这些来自燕麦本身的碳水化合物并非精制糖，而且经过稀释调配后也低了不少，叫“碳水炸弹”太夸张。
市面上常看到的几种燕麦奶数据看图。
杏仁奶
杏仁奶(注意不是巴旦木奶)通常蛋白质含量不如豆奶，碳水化合物含量也很低（不加糖的话），脂肪含量也不高，整体热量低（但还要具体产品是否浓缩了或者加糖了）。
杏仁奶含有一定的维生素E，其他方面也没什么值得一说的健康优势。
椰奶
椰奶可以算植物奶中的“叛徒”了，饱和脂肪酸含量有可能比牛奶更高。
首先要区分“椰子水”和“椰肉汁”的不同含义。“椰子水”指的是一个椰子中间的天然空心里的清澈像水的液体，椰子水热量低，糖分少，也不含多少脂肪。
“椰肉汁”则是把贴在椰子硬壳内的白色的椰肉破碎榨汁。由于椰肉有高达33%的脂肪含量，而这些脂肪里高达80%是饱和脂肪酸，因此椰肉汁不仅脂肪含量高，饱和脂肪酸含量也高。
叫“椰奶”、“椰乳”的产品多数以椰肉汁为主要原料，加了水，有的还加了糖。如果你留意一下营养成分表，会发现这类产品有的脂肪含量有的能达到17%-20%，有的「浓椰浆」甚至接近25%，light款也接近10%，这样大量摄入饱和脂肪，肯定算不上健康饮料。
不过由于没有具体标准，这类产品配方也是五花八门，也有椰肉汁、椰子水、水混起来的，这种就脂肪含量较低，具体看营养成分表挑选。
而且椰奶类产品也多半不能带来多少蛋白质和其他营养，普遍加了大量糖，总体来说不怎么推荐。
随着生椰拿铁的流行，有商家推出了「厚椰乳」用来搭配咖啡，这种产品也并没有具体的标准，常见的几款是椰肉汁＋白砂糖＋椰子水＋乳化剂＋盐等构成的，拿来配咖啡喝肯定不如只加纯牛奶、不放糖健康。
哪些人适合植物奶？
有非常严重的乳糖不耐、素食主义、对牛奶过敏等人群可以尝试尝试植物奶，比如像我有乳糖不耐受，喝一杯超大杯拿铁的话必然会腹泻，所以我很多时候会点燕麦拿铁。
不过总体上能喝牛奶的人群还是不建议彻底放弃牛奶的丰富营养价值和优秀的钙吸收率，不同植物奶产品的实际营养价值差距也是比较大的，购买时记得具体查看营养成分表。
参考资料：
[1] Whitehead A, Beck EJ, Tosh S, Wolever TM. Cholesterol-lowering effects of oat β-glucan: a meta-analysis of randomized controlled trials. Am J Clin Nutr. 2014 Dec;100(6):1413-21.
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