均线应用
1、股价在5日线上方运行说明是短线上涨走势，在20日线上方运行说明是中线上涨走势。相反，如果跌破5日线说明是短线下跌走势，跌破20日线说明是中线下跌走势。下面举例看5日20日均线的一个上涨走势图以及下跌走势图：
2、短线股在五日均线之上持股，铁坡五日均线清仓；中长线股在二十日均线之长持股，跌破二十日均线清仓。按收盘价为准，就是看收盘之前是否站上均线再决定抛出。如果行情反弹，最少要等到股价返回五日均线之后再重新介入，这也是超跌反弹的进场点，二十日均线也是如此。
3、30日均线还可以用来判断有庄无庄、庄家出没出货以及其走势强弱的标准。突破30日均线时中期走势转强且一般可确认庄家建仓完毕即拉升，从而确认中期下跌行情结束，上涨行情正式启动。一般来说，当股价向上突破30日均线是牛市最佳进场时机。
4、30日均线有着非常的走势性，当走势形成势头难改。如果生命线上涨角度陡峭有力，则说明价格中期上涨走势强烈，主力洗盘或调整至此位置可坚决狙击。反之，则走势较弱，支撑力也将疲软。同样，在价格进入下跌走势时，生命线同样可压制价格的反弹行为，促使价格持续走弱。
5、股价经过一段时间的下跌之后，5日均线在低位区域形成W底的走势时为做多信号，投资者可以在右底低点和股价向上突破5日均线的颈线时入手股票。
6、图中所显示的是5日均线，60日均线，以及年线，分为短期均线，中期均线，长期均线，当短期均线上穿中期均线时，形成金叉，此为黄金交叉，当出现时可等待3个交易日，形成技术上的突破，随后可以借机进场。
7、下图可以看出短期均线和中期均线长期处于长期均线上方呈波浪运行，虽然股价有所回落，但是大家应该知道股票不可能一直涨，从图中可以看出，回落力度太弱，基本表示空头力度太弱，主力做多意愿强烈，像这种走势的个股适合做长线，等待三个主升浪走完离场。
使用均线注意事项：
短周期的多头排列行情，那么5日均线有效死叉10日均线就需要抛出了，而中长线则需要20日均线和60日均线都被前面的短期均线死叉后，转折点确认了不是洗盘，就需要减仓或者出局。
实战案例
最后了解一下移动平均线的特点
1、MA能够表示股价的走势方向，并追踪这个方向。如果能从股价的图表中找出上升或下降走势，那么，MA将与走势方向保持一致。原始数据的股价图表不具备这个追踪走势的特性。
2、当股价突破移动平均线时，无论是向上还是向下突破，股价都有继续向突破方向发展的愿望。
3、在股价原有走势发生反转时，由于MA追踪走势的特征，使其行动往往过于迟缓，调头速度落后于大方向。这是MA一个极大的弱点。
4、根据MA的计算方法，要想较大地改变移动平均的数值，当天的股价必须有很大的变化，因为MA是股价几天变动的平均值。这种稳定性有优点，也有缺点，在应用时应多加注意，掌握好分寸。
#股市[超话]##A股[超话]##股票财经##股票[超话]#
1、股价在5日线上方运行说明是短线上涨走势，在20日线上方运行说明是中线上涨走势。相反，如果跌破5日线说明是短线下跌走势，跌破20日线说明是中线下跌走势。下面举例看5日20日均线的一个上涨走势图以及下跌走势图：
2、短线股在五日均线之上持股，铁坡五日均线清仓；中长线股在二十日均线之长持股，跌破二十日均线清仓。按收盘价为准，就是看收盘之前是否站上均线再决定抛出。如果行情反弹，最少要等到股价返回五日均线之后再重新介入，这也是超跌反弹的进场点，二十日均线也是如此。
3、30日均线还可以用来判断有庄无庄、庄家出没出货以及其走势强弱的标准。突破30日均线时中期走势转强且一般可确认庄家建仓完毕即拉升，从而确认中期下跌行情结束，上涨行情正式启动。一般来说，当股价向上突破30日均线是牛市最佳进场时机。
4、30日均线有着非常的走势性，当走势形成势头难改。如果生命线上涨角度陡峭有力，则说明价格中期上涨走势强烈，主力洗盘或调整至此位置可坚决狙击。反之，则走势较弱，支撑力也将疲软。同样，在价格进入下跌走势时，生命线同样可压制价格的反弹行为，促使价格持续走弱。
5、股价经过一段时间的下跌之后，5日均线在低位区域形成W底的走势时为做多信号，投资者可以在右底低点和股价向上突破5日均线的颈线时入手股票。
6、图中所显示的是5日均线，60日均线，以及年线，分为短期均线，中期均线，长期均线，当短期均线上穿中期均线时，形成金叉，此为黄金交叉，当出现时可等待3个交易日，形成技术上的突破，随后可以借机进场。
7、下图可以看出短期均线和中期均线长期处于长期均线上方呈波浪运行，虽然股价有所回落，但是大家应该知道股票不可能一直涨，从图中可以看出，回落力度太弱，基本表示空头力度太弱，主力做多意愿强烈，像这种走势的个股适合做长线，等待三个主升浪走完离场。
使用均线注意事项：
短周期的多头排列行情，那么5日均线有效死叉10日均线就需要抛出了，而中长线则需要20日均线和60日均线都被前面的短期均线死叉后，转折点确认了不是洗盘，就需要减仓或者出局。
实战案例
最后了解一下移动平均线的特点
1、MA能够表示股价的走势方向，并追踪这个方向。如果能从股价的图表中找出上升或下降走势，那么，MA将与走势方向保持一致。原始数据的股价图表不具备这个追踪走势的特性。
2、当股价突破移动平均线时，无论是向上还是向下突破，股价都有继续向突破方向发展的愿望。
3、在股价原有走势发生反转时，由于MA追踪走势的特征，使其行动往往过于迟缓，调头速度落后于大方向。这是MA一个极大的弱点。
4、根据MA的计算方法，要想较大地改变移动平均的数值，当天的股价必须有很大的变化，因为MA是股价几天变动的平均值。这种稳定性有优点，也有缺点，在应用时应多加注意，掌握好分寸。
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SSR分子标记实验操作及其注意事项
#生物试剂#
SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。
一、试剂配制
1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。
2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）
3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。
4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。
5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。
6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。
7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。
8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。
9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。
10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。
11.显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。
二：DNA提取过程中的注意事项
(1) 避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠球最好是一次性的，如果是反复使用的小钢珠球，必须彻底清洗干净使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。
(2) 试验材料应选取幼嫩组织，因为植物幼嫩组织DNA含量高，且多糖多酚含量少。
(3) 装入离心管的叶片组织最好不要超过离心管的1/3-1/2，否则会引起细胞裂解不完全，导致产量和纯度下降。
(4) 使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使样品磨成粉末状。
(5) 水浴前需要确保试管盖盖严，或使用辅助工具进行加固，以防止水浴时因温度较高导致试管盖开裂。
(6) 水浴过程中，每隔10-15min将离心管取出振荡摇匀，使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接触，破坏细胞结构，释放DNA。
(7) 实验过程中振荡动作不宜剧烈，移液枪头最好使用大孔枪头，移液动作不能太快，以免使DNA断裂。
(8) 当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后，倾倒离心管中多余液体时，应避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液体后，改用吸水纸吸取剩余液体。
(9) DNA风干最好在无菌操作台上进行，待乙醇彻底风干后才能加入TE或ddH2O溶解，如果有残留的乙醇，可能会影响PCR反应的试验结果。
(10) 如果DNA纯度不好，可将粗提物用溶液1×TE充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。
三：实验步骤
1、玻璃板清洗：
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。
2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。
3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。
4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）
Urea－TBE51ml
40%丙烯酰胺 9ml
10%APS 400μl
TEMED30μl
共计约60ml
2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。
4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。
3、凝胶电泳
1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。
2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。
7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。
4、银染
1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
3）用自来水（最好用双蒸水）短时间（5-10s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）将凝胶浸在显影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，显影20-30min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）用自来水（最好用双蒸水）冲洗凝胶两遍，每次2min。
6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以永久保存，也可以进行拍照记录。
四、PCR反应
1、模板及引物配制
1）模板DNA：使用25ng/μl的DNA作为模板。
2）引物：母液250M，取10μl的母液加水至100μl即得到25μM的引物。
2、DNA片段扩增：
取2uL烯释的模板DNA(25ng/uL)加入18uL如下的反应液：
H2O 13.5
10×buffer 2
dNTPs(10mM) 0.4
引物Ⅰ(25uM) 0.4
引物Ⅱ(25uM) 0.4
MgCL2(1.5mM)1.2
Taq酶(5U/uL) 0.1
Total18
混合后按如下PCR程序扩增：
Step195℃ 9M；
Step294℃ 50S；
Step3退火温度 45S；
Step472℃ 90S；
Srep5 Go to Step2，repeat 27 cycles；
Step672℃ 7M。
扩增后的样品中加入3/4体积的Loading Buffer，混合，95℃变性，待用。
五：PCR 反应实验操作注意事项
PCR 反应过程中应特别注意不要使样品相互污染， 以免造成试验结果不准确， 同时也要注意所加试剂或样品必须是经过混匀后的液体， 这样才能保证反应液各成分的浓度和体积的均一性 所用试剂需从正规商家购进， 以保证试剂的质量。
( 1) 尽量使用一次性手套 专用整套移液器 成套试剂和其他必需品， 避免外来 DNA 污染反应体系( 2) DNA 模板应稀释为适宜的浓度， 使加入 PCR反应的 DNA 样品体积最好在 4 ～ 5 l 如果 DNA 模板样品量太少， 仅有1 ～ 2 l， 不仅实验操作难度大， 而且如果操作时间长， 会导致 DNA 反应液部分或全部蒸发掉， 影响 PCR 反应结果。
( 3) 可以先将 DNA 样品加到 PCR 管底部， 再加其他 PCR 反应混合液 加样时选择不同的方位加 DNA模板和其他 PCR 反应混合液， 这样枪头靠壁加样时不会交叉污染。
( 4) 加样完毕后， 盖上盖子， 混匀反应液， 再低速离心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即进行 PCR 扩增， 需将 PCR 反应混合液置于 － 20 ℃保存备用。
( 5) PCR 扩增反应使用的酶不能长时间放置于室温下， 须随用随取， 使用完毕后立即放回 － 20 ℃冰箱否则， 酶易失活。
( 6) PCR 反应的退火温度应根据不同的引物来确定最佳退火温度， 以确保扩增的条带中杂带少， 目标带明显， 引物退火温度一般按照 Tm = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式计算。
#生物试剂#
SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。
一、试剂配制
1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。
2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）
3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。
4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。
5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。
6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。
7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。
8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。
9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。
10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。
11.显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。
二：DNA提取过程中的注意事项
(1) 避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠球最好是一次性的，如果是反复使用的小钢珠球，必须彻底清洗干净使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。
(2) 试验材料应选取幼嫩组织，因为植物幼嫩组织DNA含量高，且多糖多酚含量少。
(3) 装入离心管的叶片组织最好不要超过离心管的1/3-1/2，否则会引起细胞裂解不完全，导致产量和纯度下降。
(4) 使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使样品磨成粉末状。
(5) 水浴前需要确保试管盖盖严，或使用辅助工具进行加固，以防止水浴时因温度较高导致试管盖开裂。
(6) 水浴过程中，每隔10-15min将离心管取出振荡摇匀，使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接触，破坏细胞结构，释放DNA。
(7) 实验过程中振荡动作不宜剧烈，移液枪头最好使用大孔枪头，移液动作不能太快，以免使DNA断裂。
(8) 当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后，倾倒离心管中多余液体时，应避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液体后，改用吸水纸吸取剩余液体。
(9) DNA风干最好在无菌操作台上进行，待乙醇彻底风干后才能加入TE或ddH2O溶解，如果有残留的乙醇，可能会影响PCR反应的试验结果。
(10) 如果DNA纯度不好，可将粗提物用溶液1×TE充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。
三：实验步骤
1、玻璃板清洗：
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。
2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。
3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。
4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）
Urea－TBE51ml
40%丙烯酰胺 9ml
10%APS 400μl
TEMED30μl
共计约60ml
2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。
4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。
3、凝胶电泳
1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。
2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。
7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。
4、银染
1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
3）用自来水（最好用双蒸水）短时间（5-10s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）将凝胶浸在显影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，显影20-30min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）用自来水（最好用双蒸水）冲洗凝胶两遍，每次2min。
6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以永久保存，也可以进行拍照记录。
四、PCR反应
1、模板及引物配制
1）模板DNA：使用25ng/μl的DNA作为模板。
2）引物：母液250M，取10μl的母液加水至100μl即得到25μM的引物。
2、DNA片段扩增：
取2uL烯释的模板DNA(25ng/uL)加入18uL如下的反应液：
H2O 13.5
10×buffer 2
dNTPs(10mM) 0.4
引物Ⅰ(25uM) 0.4
引物Ⅱ(25uM) 0.4
MgCL2(1.5mM)1.2
Taq酶(5U/uL) 0.1
Total18
混合后按如下PCR程序扩增：
Step195℃ 9M；
Step294℃ 50S；
Step3退火温度 45S；
Step472℃ 90S；
Srep5 Go to Step2，repeat 27 cycles；
Step672℃ 7M。
扩增后的样品中加入3/4体积的Loading Buffer，混合，95℃变性，待用。
五：PCR 反应实验操作注意事项
PCR 反应过程中应特别注意不要使样品相互污染， 以免造成试验结果不准确， 同时也要注意所加试剂或样品必须是经过混匀后的液体， 这样才能保证反应液各成分的浓度和体积的均一性 所用试剂需从正规商家购进， 以保证试剂的质量。
( 1) 尽量使用一次性手套 专用整套移液器 成套试剂和其他必需品， 避免外来 DNA 污染反应体系( 2) DNA 模板应稀释为适宜的浓度， 使加入 PCR反应的 DNA 样品体积最好在 4 ～ 5 l 如果 DNA 模板样品量太少， 仅有1 ～ 2 l， 不仅实验操作难度大， 而且如果操作时间长， 会导致 DNA 反应液部分或全部蒸发掉， 影响 PCR 反应结果。
( 3) 可以先将 DNA 样品加到 PCR 管底部， 再加其他 PCR 反应混合液 加样时选择不同的方位加 DNA模板和其他 PCR 反应混合液， 这样枪头靠壁加样时不会交叉污染。
( 4) 加样完毕后， 盖上盖子， 混匀反应液， 再低速离心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即进行 PCR 扩增， 需将 PCR 反应混合液置于 － 20 ℃保存备用。
( 5) PCR 扩增反应使用的酶不能长时间放置于室温下， 须随用随取， 使用完毕后立即放回 － 20 ℃冰箱否则， 酶易失活。
( 6) PCR 反应的退火温度应根据不同的引物来确定最佳退火温度， 以确保扩增的条带中杂带少， 目标带明显， 引物退火温度一般按照 Tm = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式计算。
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避雷【十二点女舍副团长】前几个都被吞
❗同时ai昧＋无缝衔接
❗wcn给他人看隐s部位、开H腔
❗you导消费，背后说板坏话，造yao老板
❗盗用照片
⭐今天主人公：十二点高管无语（原名：筱）欢迎各位走进陪玩瓜田
不查不知道，一查吓一跳，受害者排一队居然都可以绕地球一圈。居然同时和三个人ai昧，而且现实生活中还有喜欢的人，该说你“深情”还是“深情”呢。
（一）下面请出我们的第一组受害者，编号分别为1、2、3号()
⭕第一位受害者在抖音直播间认识无语，经过一段时间的聊天后表示感兴趣，并在23年2月11日左右在一起，后因为一些原因分手拉黑，9月份重新找到1号让她进团，与此同时无语有ai昧对象圈名为九月，1号对于两人的关系一概不知，无语也并没有解释或者说明两人已经在一起了，在双方都不知情的情况下，表示想与1号在一起，并且说：九月做明面的宝宝，1号做私底下的宝宝。九月得知真相之后询问，无语直接将其删好友，并与1号在一起，期间无语打视频露yin私部位。无语姐姐你当时还是wcn哎，也不至于这么做吧。
⭕23年9月18日与1号分手，但是一直保持ai昧，23年12月在第二位受害者不知情的情况下与其搞ai昧，此时无语依然在与1号ai昧，被拆穿后瞒着2号，给1号道歉、开H腔，但由于想要和2号在一起，不久后和1号闹掰，紧接着在23年12月16日给2号表白并且要求在一起，意见不合和2号分手后重新找回1号，解释说和2号谈是为了气她，实际上一点都不喜欢，背后骂e心，那么请问我们的无语姐姐，当初和2号谈的时候可没有告诉她这些事哦。
⭕ 分手后不到10天的时间又找到了第三位受害者，开始故伎重演，于24年1月3日对3号采取一系列行动，背后说3号是t狗，当面一套背后一套的本领无师自通啊。1月7日表示对3号不感兴趣后转身将她作为自己的ATM机器，利用关系多次y导消费，此时3号已经成为老板（陪转板），无语便强烈要求3号的专属接待是她，明确告诉老板群内后缀加她的名字，多次诱导老板消费、包夜，并且要求写虚假板评。
（二）如果只有这一个老板我们姑且不过多评价，那么请问，多个老板同时投诉是怎么情况呢？
⭕下面我们来看下一位受害者老板（老板表示心里有苦说不出啊）。
在与老板聊天过程中多次提到：“求你包夜”“点我”“包我”一系列的词汇，老板转账后再次要求点单，老板拒绝，无语随即删除老板好友，并且在闲聊群内辱ma老板，造y老板喜欢她，并且向其他人倾诉时w辱老板攻击年龄。
（三）⭕关于wcn给多人发yin私照这个事情，想必我们的无语很有经验，看见一个人就想着做i，并且不分场合不分对象的开H腔，吓跑众多朋友，请问现在您还有朋友吗？打视频给别人看隐s部位，您真是饿了，什么都吃得下。
（四）⭕拿喜欢的人的照片去给ai昧对象说这是自己，拜托人家可是直女哎，而且当时有男朋友了，可是你在背后怎么对待喜欢的人呢，毋庸置疑又是开H腔喽，真有你的呢 https://t.cn/A6lYod8s
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