#飞傲2024年新品预告# ⑯ 配件与线材篇。
说起来，飞傲创业的定位就是做中国的“贝尔金”。现在回过头看还是要佩服自己的“远见卓识”的。毕竟ANKER， 绿联做成了这件事，营收规模都大几十亿而且上市了。所以方向是没错的。错的只是自己的能力不足。
因此，我反复的和朋友同事说，我们要做的只有一件事情，不要好高骛远乱想，乱追啥概念。这个世界，对我们这样的人来说，从来不是“知难行易”，而是“知易行难”。能把简单的事情，日复一日的做好其实大概率就可以成功的。
扯远了，还是要说一下飞傲的配件和线材。这些配件线材其实都是围绕着飞傲自己的产品，为飞傲用户服务的。所以我们的业务重点也不在此，但是还是值得说道说道的。
1，飞傲多功能底座DK1Pro。
飞傲做底座类产品起家的。主要也是看到苹果iPod的底座系列（包括底座音箱）卖的这么好。一个方便好用的底座是能够大幅提升用户体验的。
DK1Pro的定位，就是把带TYPE C接口的手机插上去，连接带USB输入的台式解码器，这样就可以组合成一个非常好用的流媒体播放器了。
当然，大家可能会说，我在PDD上买个便宜的手机支架，弄根USB线也一样可以啊。但是我们的区别就在于，这个底座在手机通过USB输出音频信号的同时，底座接上电源，还可以同时给手机供电。而且还支持快充（只要手机支持通用的PD快充协议）。
另外，底座上有3个TYPE C口，这样除了一个供电口，一个USB口，还可以插一个移动存储设备如U盘，这样大大扩展了手机的存储容量。
另外，相比通用支架相对繁琐的安装连接。DK1Pro可以非常简单的将产品插上即可。而且不仅可以支持普通的手机，我试过12寸的iPad Pro平板也一样支持。
所以，一台过时的安卓手机+一个飞傲的蓝牙遥控器+DK1Pro+K9Pro这样的台式解码耳放+飞傲SP3+飞傲FT5，这就是一套在功能上可能秒杀任何流媒体播放器所组合的系统啊。
DK1Pro预计是24年3月上市，首批数量很少（几百台），因为同事不太看好，我倒是信心满满。产品的视频可以参考我之前发的微博： https://t.cn/A6jaL08p，https://t.cn/A6jaL08O
2, 古河单晶铜大耳升级线LL-RC。
这个是可换插头转双3.5mm插头，主要用于配飞傲的头戴耳机，同时也适合一些其它品牌的大耳；线芯材料为4股共560芯同轴编织结构，古河单晶铜。我们原有特意屯的古河单晶铜线材已经用完，这个线铜材是从古河购买后在台湾重新加工而成；有1.5米和3米长度规格，后面FT3的生产也将切换使用此线材。
这里说一下，很久以前古河就停产了用于HIFI行业的单晶铜线基，但是发烧友要分清楚单晶铜和单晶铜线基的区别。单晶铜线基是用单晶铜材料来加工的。所以也有品牌说，线材是古河单晶铜二次冶炼。这其中的奥秘大家可以自己品味吧。
不管怎么说，能够继续用上古河单晶铜还是件值得庆贺的事情的。
LL-RC预计2月份上市。
3，纯银头戴耳机升级线 LL-RD 2024
可换插头转双3.5mm插头，主要用于配飞傲的头戴耳机；线芯材料为4股共392芯纯银线基，同我们现款在售的小耳机升级线LC-RD相同规格的线芯。长度:1.5米，预计上市时间：24年3月。
这个线材主要是满足一些大耳用户调音的需要，纯银线材被认为是可以有效的提升高频的润泽度和鲜艳度。也是广受发烧友喜爱的常用线材。
而且，要我说，买纯银线还有一个好处。以后不需要了还可以打个银首饰啥的[笑cry]
以下则是一些老型号线材采用全新设计的升级型号，共性是采用全新的椭圆造型，一体化铸工艺，镀金插头，更好手感、质感。线芯全都升级成纯铜镀银线，使用更耐磨的鱼丝编网（俗称钓鱼线）外被，线材长度都有短，中，长三种规格。
这些线材有部分型号都已经入库，我们希望等到货后统一安排宣传和上架。否则真的忙不过来了。
4，OTG转线充电线（LT-TC5）/图一。
5，双RCA模拟音频线和RCA同轴线（LR-RCA4）/图2
6，数字音频同轴线（LC-RCA5）/图3
7, 双头XLR平衡信号线（这个只有1.5米的规格）/图4
8，其他线材
另外我们还有一些其他线材也会陆续做出来，以满足我们不同产品的连接需求，如3.5转同轴/光纤线，台式产品的接大地的专用线材等。
到此，我们2024年所有的新品预告均已完成。实际执行过程中，肯定还会有一些调整和变动。因此仅供大家参考。
#飞傲2024年新品预告# 汇总贴。 https://t.cn/A6j20176
说起来，飞傲创业的定位就是做中国的“贝尔金”。现在回过头看还是要佩服自己的“远见卓识”的。毕竟ANKER， 绿联做成了这件事，营收规模都大几十亿而且上市了。所以方向是没错的。错的只是自己的能力不足。
因此，我反复的和朋友同事说，我们要做的只有一件事情，不要好高骛远乱想，乱追啥概念。这个世界，对我们这样的人来说，从来不是“知难行易”，而是“知易行难”。能把简单的事情，日复一日的做好其实大概率就可以成功的。
扯远了，还是要说一下飞傲的配件和线材。这些配件线材其实都是围绕着飞傲自己的产品，为飞傲用户服务的。所以我们的业务重点也不在此，但是还是值得说道说道的。
1，飞傲多功能底座DK1Pro。
飞傲做底座类产品起家的。主要也是看到苹果iPod的底座系列（包括底座音箱）卖的这么好。一个方便好用的底座是能够大幅提升用户体验的。
DK1Pro的定位，就是把带TYPE C接口的手机插上去，连接带USB输入的台式解码器，这样就可以组合成一个非常好用的流媒体播放器了。
当然，大家可能会说，我在PDD上买个便宜的手机支架，弄根USB线也一样可以啊。但是我们的区别就在于，这个底座在手机通过USB输出音频信号的同时，底座接上电源，还可以同时给手机供电。而且还支持快充（只要手机支持通用的PD快充协议）。
另外，底座上有3个TYPE C口，这样除了一个供电口，一个USB口，还可以插一个移动存储设备如U盘，这样大大扩展了手机的存储容量。
另外，相比通用支架相对繁琐的安装连接。DK1Pro可以非常简单的将产品插上即可。而且不仅可以支持普通的手机，我试过12寸的iPad Pro平板也一样支持。
所以，一台过时的安卓手机+一个飞傲的蓝牙遥控器+DK1Pro+K9Pro这样的台式解码耳放+飞傲SP3+飞傲FT5，这就是一套在功能上可能秒杀任何流媒体播放器所组合的系统啊。
DK1Pro预计是24年3月上市，首批数量很少（几百台），因为同事不太看好，我倒是信心满满。产品的视频可以参考我之前发的微博： https://t.cn/A6jaL08p，https://t.cn/A6jaL08O
2, 古河单晶铜大耳升级线LL-RC。
这个是可换插头转双3.5mm插头，主要用于配飞傲的头戴耳机，同时也适合一些其它品牌的大耳；线芯材料为4股共560芯同轴编织结构，古河单晶铜。我们原有特意屯的古河单晶铜线材已经用完，这个线铜材是从古河购买后在台湾重新加工而成；有1.5米和3米长度规格，后面FT3的生产也将切换使用此线材。
这里说一下，很久以前古河就停产了用于HIFI行业的单晶铜线基，但是发烧友要分清楚单晶铜和单晶铜线基的区别。单晶铜线基是用单晶铜材料来加工的。所以也有品牌说，线材是古河单晶铜二次冶炼。这其中的奥秘大家可以自己品味吧。
不管怎么说，能够继续用上古河单晶铜还是件值得庆贺的事情的。
LL-RC预计2月份上市。
3，纯银头戴耳机升级线 LL-RD 2024
可换插头转双3.5mm插头，主要用于配飞傲的头戴耳机；线芯材料为4股共392芯纯银线基，同我们现款在售的小耳机升级线LC-RD相同规格的线芯。长度:1.5米，预计上市时间：24年3月。
这个线材主要是满足一些大耳用户调音的需要，纯银线材被认为是可以有效的提升高频的润泽度和鲜艳度。也是广受发烧友喜爱的常用线材。
而且，要我说，买纯银线还有一个好处。以后不需要了还可以打个银首饰啥的[笑cry]
以下则是一些老型号线材采用全新设计的升级型号，共性是采用全新的椭圆造型，一体化铸工艺，镀金插头，更好手感、质感。线芯全都升级成纯铜镀银线，使用更耐磨的鱼丝编网（俗称钓鱼线）外被，线材长度都有短，中，长三种规格。
这些线材有部分型号都已经入库，我们希望等到货后统一安排宣传和上架。否则真的忙不过来了。
4，OTG转线充电线（LT-TC5）/图一。
5，双RCA模拟音频线和RCA同轴线（LR-RCA4）/图2
6，数字音频同轴线（LC-RCA5）/图3
7, 双头XLR平衡信号线（这个只有1.5米的规格）/图4
8，其他线材
另外我们还有一些其他线材也会陆续做出来，以满足我们不同产品的连接需求，如3.5转同轴/光纤线，台式产品的接大地的专用线材等。
到此，我们2024年所有的新品预告均已完成。实际执行过程中，肯定还会有一些调整和变动。因此仅供大家参考。
#飞傲2024年新品预告# 汇总贴。 https://t.cn/A6j20176
#大兜商店#
PORT杂志 issue 33 AW23| 英国男性时尚
/
重新设计！最新一期的《Port》又有了新的面貌，尤其是去掉了马特·威利（Matt Willey）大胆的块状刊头，取而代之的是每期五位封面明星各自手绘的不同版本：塔伊加·维迪提（Taika Waititi）、Teo Yoo、贾丝明·乔布森（Jasmine Jobson）、蔡国强和弗朗茨·罗戈夫斯基（Franz Rogowski）。
关于这个过程，团队解释说：“这是不能强求的——在拍摄现场，弗朗茨·罗戈夫斯基画完了《Port》的标志后，我们要求他再给我们一些其他选择。他拒绝了，告诉我们如果再要求更多，那就是我们的解读，而不是他的了。他是对的。”
这又是一期内容丰富的杂志，新增了一些板块——“Portfolio”汇集了一些创意人士，而“Commentary”则是一个马特风格的文学板块，收录了扎迪·史密斯（Zadie Smith）和菲利普pa·斯诺（Philippa Snow）等人的作品——以及《Port Review of Design》，这是一个专门介绍设计的过往和现在的插页，由德扬·苏迪克（Deyan Sudjic）编辑（他也是上一期《Port》附带的一次性设计出版物《Anima》的负责人）。
PORT杂志 issue 33 AW23| 英国男性时尚
/
重新设计！最新一期的《Port》又有了新的面貌，尤其是去掉了马特·威利（Matt Willey）大胆的块状刊头，取而代之的是每期五位封面明星各自手绘的不同版本：塔伊加·维迪提（Taika Waititi）、Teo Yoo、贾丝明·乔布森（Jasmine Jobson）、蔡国强和弗朗茨·罗戈夫斯基（Franz Rogowski）。
关于这个过程，团队解释说：“这是不能强求的——在拍摄现场，弗朗茨·罗戈夫斯基画完了《Port》的标志后，我们要求他再给我们一些其他选择。他拒绝了，告诉我们如果再要求更多，那就是我们的解读，而不是他的了。他是对的。”
这又是一期内容丰富的杂志，新增了一些板块——“Portfolio”汇集了一些创意人士，而“Commentary”则是一个马特风格的文学板块，收录了扎迪·史密斯（Zadie Smith）和菲利普pa·斯诺（Philippa Snow）等人的作品——以及《Port Review of Design》，这是一个专门介绍设计的过往和现在的插页，由德扬·苏迪克（Deyan Sudjic）编辑（他也是上一期《Port》附带的一次性设计出版物《Anima》的负责人）。
关于质粒提取的小技巧
内容：
现在用质粒提取试剂盒非常方便，而且菌体培养后，可以多管浓缩提取，提到的质粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、转化等实验，可以提前跑个胶，只要不降解，就可以继续用，避免每次要用，都要培养一遍再提取一遍。
1.质粒DNA提取
提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。
将amp浓度提高到200μg/mL，下班前接种，次日一早收获菌体，此时OD虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操作体积(管数)也小(少)。
手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。
2. Western Blot
做western blot的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。
做western blot转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。
器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。
配胶最好现用现配，先配下层胶(分离胶)，后配上层胶(浓缩胶或积层胶)，而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入1～2次即可。
3. 缓冲液和培养基配置
(1)将缓冲液配方中的成分分别以10～100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可;
(2)配培养基时通常会忘记各成分的量，如，配LB时的三个成分不记得到底哪个是5 g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如，配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L，yeast5g/L，tryton10g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。
4. PCR
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应)，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在-20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：
(1)可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球;
(2)避免每次反应加样不均的可能;
(3)大大减少PCR假阳性的产生。
5. 酶切
如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因为，TE里面的离子会影响酶切的效率。双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后，再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：
(1)各反应成分均一;
(2)可大大减少限制型内切酶的使用;
(3)节省时间。
6.大肠杆菌转化实验
有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上，BL21就长得快)，下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基)，50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省6~8小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。
转化时一定要做一个宿主菌的对照，即，重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于BL21可以在Amp(+)的平板上面生长。
7.蛋白质的表达、分离、纯化
当蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，最有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60%以上。
8. PCR扩增产物的克隆
引物设计主要是要注意以下几个事项：
(1)发夹结构;
(2)反向配对;
(3)GC含量(40～60%);
(4)退火温度(45～65度);
(5)引物长度(18～27bp);
(6)3'端最好是C、G(提高结合度);
(7)引物在序列中的错配位点;
※大致就这几个方面，重要性依次降低，由其是3'端绝对不能形成发夹结构。
那么你说你这段能不能设计引物呢?其实设计引物都只是好中选优的问题。
9.细胞冻存和复苏实验
(1)可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和pH值都已经最适合细胞生长了。
(2)为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了：稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
(3)水浴温度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37℃。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
10.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
(1)RT-PCR有两种做法
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。
(2)RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5‘，3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
(3)RACE
我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5’RACE是Gibico)，但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列(RACE的方法)，而另一个基因的3‘UTR却怎么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故。
公众号：毕合生物
毕合生物（www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物
内容：
现在用质粒提取试剂盒非常方便，而且菌体培养后，可以多管浓缩提取，提到的质粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、转化等实验，可以提前跑个胶，只要不降解，就可以继续用，避免每次要用，都要培养一遍再提取一遍。
1.质粒DNA提取
提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。
将amp浓度提高到200μg/mL，下班前接种，次日一早收获菌体，此时OD虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操作体积(管数)也小(少)。
手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。
2. Western Blot
做western blot的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将PVDF膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。
做western blot转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。
器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。
配胶最好现用现配，先配下层胶(分离胶)，后配上层胶(浓缩胶或积层胶)，而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入1～2次即可。
3. 缓冲液和培养基配置
(1)将缓冲液配方中的成分分别以10～100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可;
(2)配培养基时通常会忘记各成分的量，如，配LB时的三个成分不记得到底哪个是5 g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如，配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L，yeast5g/L，tryton10g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。
4. PCR
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应)，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在-20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：
(1)可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球;
(2)避免每次反应加样不均的可能;
(3)大大减少PCR假阳性的产生。
5. 酶切
如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解DNA，因为，TE里面的离子会影响酶切的效率。双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后，再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：
(1)各反应成分均一;
(2)可大大减少限制型内切酶的使用;
(3)节省时间。
6.大肠杆菌转化实验
有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上，BL21就长得快)，下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基)，50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省6~8小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。
转化时一定要做一个宿主菌的对照，即，重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于BL21可以在Amp(+)的平板上面生长。
7.蛋白质的表达、分离、纯化
当蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，最有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60%以上。
8. PCR扩增产物的克隆
引物设计主要是要注意以下几个事项：
(1)发夹结构;
(2)反向配对;
(3)GC含量(40～60%);
(4)退火温度(45～65度);
(5)引物长度(18～27bp);
(6)3'端最好是C、G(提高结合度);
(7)引物在序列中的错配位点;
※大致就这几个方面，重要性依次降低，由其是3'端绝对不能形成发夹结构。
那么你说你这段能不能设计引物呢?其实设计引物都只是好中选优的问题。
9.细胞冻存和复苏实验
(1)可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和pH值都已经最适合细胞生长了。
(2)为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了：稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
(3)水浴温度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37℃。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
10.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
(1)RT-PCR有两种做法
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。
(2)RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5‘，3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
(3)RACE
我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5’RACE是Gibico)，但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列(RACE的方法)，而另一个基因的3‘UTR却怎么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故。
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