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百田你真该亖啊，真的给我干的匪夷所思了，我想了两个月也没想明白你到底抽的什么风，抽的羊癫疯吗。

#分生复健#
在前实验室（大组）构对过起码两三百个质粒，同源重组和酶切酶连都做过很多，其实也没那么大感觉，因为每次瞎做都能出（比如切胶条带够亮片段不测浓度不算片段比例直接统一加1微这种，有的时候新切载体也忘记做对照）。甚至构靶点的时候自信到只挑一个菌送测，挑一个对一个。
我知道那是为什么，是成熟的实验节奏、稳定的试剂、大量同时重复、别人用过的载体和方法。所有人都在做分子克隆的时候很容易发现系统错误（比如试剂过期或者不好用了），并且有其他人替你纠正（告诉你不好用了换一个牌子或者换了批号）。用的载体都有师兄师姐试过千八百遍了，都是work的。大组和测序公司有VIP合同，不用每次等试做。说白了，所有坑都有人替你踩过了，效率真的很高，所以才能每年发3篇子刊是吧。。
现在重新构病毒载体，首先质粒序列不知道就够麻烦了，不得不送二代测序测了个全长。然后这b质粒居然还是用gateway kit构的载体，显然我们经费有限用不起这么贵的东西。年代久远的笔记里用的写着“work”的引物，一测序就套峰，猜到大概是在载体里有大于1的binding site，二代出结果发现确实如此，有2个。另一个写着是装在表达载体里的cds，拿表达载体的通用引物测序居然测不出，反复拿质粒序列blast也无果，灵机一动想到有没有可能是克隆载体，试了引物测出来果然是，我说小抽浓度怎么差那么多呢？才知道之前可能是别人（甚至不是我们实验室的）扩错了。
说起来，找到这个酶切位点也很神奇。这个质粒太大，在插入片段两端没有合适的单酶切位点。最后我用的这个酶其实在整个载体里有三个识别位点，正常做克隆筛到2个酶切位点到头了。这个酶切位点为什么能用，因为它三个位点中影响病毒元件的那个位点，正好前面是个G。GATC只要在野生型DH5α里扩增就会被Dam甲基化，这个内切酶正好受到空间位阻切不动Dam甲基化位点，相当于三个酶切位点它只会切两刀，正好可以把插入片段扔掉又不破坏病毒元件，留下两个相同的粘性末端，太奇妙了。。
最后片段拿了，载体酶切了。最搞笑的是试了三家高保真酶，NEB的p不出（当然，虽然不一定是NEB的问题，但同样按照protocol做一次，neb一片空白），国产的酶p出来了，跑电泳还巨亮。第一次连接涂板挑了14个全部无信号，第二次涂板长了两个，然后我不是腰突犯了去医院了，不得不让师姐帮忙挑了摇起来送测，昨天回结果，终于对了一个。
有些关于测序公司的小经验。比如说可以给测序公司发邮件让它给我没处理过的ab1文件，能多一些信息。测序失败的文件不完全是没用的，也能给一些信息。这次尝试的一种偷懒的搞法是，可以等公司返样质粒，省得我自己小抽了，我有需要的时候再扩培或者快转都ok。因为他们测菌液的时候也是提的质粒，测序完了总有剩的。
构出来这一个质粒实在是比之前构对那几百个都有成就感。但是确实有意思啊，这么好玩呢。

#角色单人cut[超话]##色链分享#
碧苍王.cube
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