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中华人民共和国国家标准
GB 5009.89-2023
食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定 第二法
（转载自：https://t.cn/A6TdcCWM）
前言
本标准代替GB 5009.89-2016《食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定》。
本标准与GB 5009.89-2016相比，主要变化如下：
——高效液相色谱法调整为第一法，微生物法调整为第二法；
——增加了第二法 微生物法中的微孔板法、试样处理后调节pH的要求；
——修改了第二法 微生物法的标准曲线浓度范围、精密度和定量限。
1范围
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法适用于调制乳粉、特殊膳食用食品（不包括乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方以及氨基酸代谢障碍配方的特殊医学用途婴儿配方食品）和特殊用途饮料中烟酸和烟酰胺的测定，第二法适用于食品中烟酸（或烟酰胺）的测定。
第二法 微生物法
9原理
烟酸和烟酰胺是植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）生长所必需的营养素，在烟酸测定培养基中，植物乳植杆菌的生长与烟酸（或烟酰胺）的含量呈相关性，根据烟酸（或烟酰胺）含量与透光率（或吸光度）的标准曲线计算出试样中烟酸（或烟酰胺）含量。
10试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水或二级水。
10.1菌株
植物乳植杆菌（ Lactiplantiacillus plantarum ）（原植物乳杆菌， Lactobacillus plantarum ）ATCC 8014或等效菌株。
10.2 培养基
10.2.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录B中B.1。
10.2.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录 B中B.2。
10.2.3烟酸测定用培养基：见附录B中 B.3。
注：可使用商品化的合成培养基，按照说明书操作。
10.3试剂
10.3.1 无水乙醇（C2H5OH）。
10.3.2硫酸（H2SO4）：95%~98%。
10.3.3氢氧化钠（NaOH）。
10.3.4氯化钠（NaCl）。
10.4试剂配制
10.4.1乙醇溶液（体积分数为25%）：量取250 mL无水乙醇，加水定容至1 000 mL。
10.4.2硫酸溶液 A（10 mol/L）：量取560 mL硫酸，加入水中，稀释至1 000 mL。
10.4.3硫酸溶液 B（0.5 mol/L）：量取50 mL硫酸溶液A（10 mol/L） ，加入水中，稀释至1 000 mL。
10.4.4氢氧化钠溶液 A（10 mol/L）：称取400 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 000 mL。
10.4.5氢氧化钠溶液 B（0.1 mol/L）：吸取10 mL氢氧化钠溶液A（10 mol/L）， 加水稀释至1 000 mL。
10.4.6无菌生理盐水（8.5 g/L）：称取8.5 g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，分装于具塞试管，每管10 mL， 121℃高压灭菌15 min。
10.5标准品
10.5.1烟酸（C6H5NO2，CAS号：59-67-6） ：纯度≥98% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.5.2烟酰胺（C6H6N2O，CAS号：98-92-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.6标准溶液配制
10.6.1烟酸（或烟酰胺）标准储备液（50 μg/mL）：将烟酸（或烟酰胺）标准品置于含五氧化二磷的干燥器中，干燥过夜。按纯度称取，使烟酸（或烟酰胺）含量为50.0 mg（精确至0.001 g） ，用乙醇溶液（25%）溶解移入1000mL容量瓶，定容至刻度。
10.6.2烟酸（或烟酰胺）标准中间液（500ng/mL）：吸取1.0mL烟酸（或烟酰胺）标准储备液（50μg/mL）至100mL容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容至刻度。
10.6.3烟酸（或烟酰胺）标准工作液：分两个质量浓度，高质量浓度溶液的质量浓度为10ng/mL；低质量浓度溶液的质量浓度为5ng/mL。从中间液中（500ng/mL）吸取2次，各2mL，分别移入100mL和200mL容量瓶，用水定容至刻度。
注：配制标准溶液使用棕色容量瓶，配制后的标准溶液要用棕色试剂瓶2℃~8℃冷藏于冰箱内。标准储备液和中间液保存期6个月，标准使用液临用现配。
11仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
11.1 分析天平：感量为0.1 mg。
11.2 离心机。
11.3 涡旋混合器。
11.4 pH计：精度为0.01。
11.5 恒温培养箱：36℃±1℃。
11.6 分光光度计：540 nm~660 nm。
1.7 酶标仪：540 nm~660 nm。
11.8 冰箱：2℃~8℃。
11.9 无菌微孔板。
11.10 定量滤纸：直径90 mm。
11.11 试管：18 mm×180 mm。
11.12 容量瓶：容量100 mL、200 mL、250 mL、500 mL。
11.13 单刻度移液管：1 mL、5 mL、10 mL。
11.14 刻度吸管：5 mL（具0.1 mL刻度）。
11.15 玻璃漏斗：直径100 mm。
11.16 锥形瓶：容量250 mL。
11.17 烧杯：容量100 mL。
11.18 分液器：0 mL~10 mL。
11.19 微量移液器：1 000 μL，200 μL。
11.20 无菌离心管：1.5 mL。
11.21 针头过滤器：孔径0.22 μm。
注：清洗后的玻璃器皿和金属器具应在250℃下干热1 h~2 h。
12 分析步骤
12.1测试菌悬液制备
12.1.1 将植物乳植杆菌菌株活化后，用接种针穿刺接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36℃±1℃培养16 h~24 h，再转种2代~3代以增强活力。以斜面培养物方式置冰箱冷藏，可保存1个月。
12.1.2 将24 h内活化后的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，36℃±1℃培养16 h~24 h。以3 000 r/min~5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL生理盐水，用涡旋混合器振荡该悬液，再离心约5 min，弃去上清液。如前操作清洗2次~3次后，再加10 mL生理盐水，振荡混匀。吸取适量该菌悬液于10mL生理盐水中，混匀制成测试菌悬液。
12.1.3 以生理盐水做空白，用分光光度计于550 nm波长下测定测试菌悬液透光率（%T），调整上述菌液加入量，使测试菌悬液透光率在60%T ~80%T。
12.2试样提取
块状、颗粒状试样需粉碎；乳粉、米粉等粉状试样需混匀；果蔬、肉、蛋、鱼、动物内脏等需制成食糜；半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。
12.2.1固态试样：准确称取（精确至0.001 g）试样于锥形瓶中，其中新鲜果蔬试样2 g~5 g；谷类、豆类、坚果类、内脏生肉、干制试样0.2 g~1 g；乳粉、米粉等试样2 g~3g；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1 g~0.5 g；其他食品0.2 g~1 g。
12.2.2液体饮料或流质、半流质试样：称取5g~10g（精确至0.001g）（或用单刻度移液管吸取适量体积）于锥形瓶中。特殊用途饮料称取样品后不需按12.2.3 进行处理，称样后直接定容至100 mL（V）后，按12.2.4进行稀释。
如果试样烟酸（或烟酰胺）含量过低，可适当提高称样量。
12.2.3加入试样质量（以克计）10倍的硫酸溶液B（以毫升计），将上述混合物放入压力蒸汽灭菌器，121℃下水解30 min，取出迅速水浴冷却至室温。用氢氧化钠溶液A和氢氧化钠溶液B调节pH至4.5±0.2，移入250 mL（V）容量瓶中，用水定容至刻度。
用定量滤纸过滤，最初约10 mL滤液应弃去，吸取5 mL（V2）滤液于100 mL烧杯中，加水约20 mL，用氢氧化钠溶液B调节pH至6.8±0.2，移入100 mL（V）容量瓶中加水定容至刻度。
12.2.4稀释：根据试样中烟酸（或烟酰胺）含量用水对提取液进行适当稀释，使稀释后试样提取液中烟酸（或烟酰胺）质量浓度为5 ng/mL~12 ng/mL。
12.3 试样测定
12.3.1 试管培养法
12.3.1.1 标准曲线系列管
按表1顺序加入水、标准曲线工作液和烟酸测定用培养基至培养试管中，表1中每一编号需制作3管。未接种空白试管（UN）、 接种空白试管（IN）、标准系列管S1~S8中烟酸（或烟酰胺）质量浓度分别为0 ng、0 ng、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/ mL、25 ng/ mL、30 ng/ mL、40 ng/mL、50 ng/ mL。
image.png
12.3.1.2试样系列管
按表2顺序加入水、试样提取液和烟酸测定用培养基至培养试管中，表中每一编号需制作3管。
image.png
12.3.1.3 灭菌
将标准曲线系列管和试样系列管放入压力蒸汽灭菌器，121℃下灭菌5 min（商品培养基按标签说明进行灭菌），取出后迅速用水浴冷却到室温。为了保证加热和冷却过程中温度均匀，灭菌试管不应距离灭菌器内壁过近，试管摆放不应过密，以免影响空气流通。
12.3.1.4 接种
在无菌条件下，向.上述每管中（标准曲线未接种空白管UN除外）各加入1滴（50μL~ 100 μL）测试菌液，加盖，充分振荡混匀所有培养管。
12.3.1.5培养
将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃下培养18 h~24 h。
12.3.1.6测定
培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种空白试管（UN）内培养液应是澄清的，标准曲线系列管和试样系列管中培养液的吸光度应有梯度差别。未接种空白试管（UN）若混浊，则测定无效。
12.3.1.6.1用未接种空白试管（UN）作空白，将分光光度计透光率调至100%T ，读出接种空白试管（IN）的读数。再以接种空白试管（IN）为空白，调节透光率为100%T ，依次读出其他试管的透光率（%T） （或吸光度A）。
12.3.1.6.2用涡旋混合器充分混合每一支试管（也可以加一-滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内，在550 nm波长下进行比色。待读数稳定后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。依次读出其他试管的透光率。透光率超出标准曲线管S1~S8覆盖的浓度范围的培养管要舍去。以烟酸或烟酰胺标准品的质量浓度为横坐标，透光率为纵坐标绘制标准曲线。
注：绘制标准曲线，也可以吸光度A作纵坐标。
12.3.1.6.3对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率或吸光度计算每毫升试样提取液中烟酸（或烟酰胺）的浓度，并计算该编号提取液的烟酸（或烟酰胺）浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15% ：超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有4个编号提取液总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数不少于原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升提取液中烟酸（或烟酰胺）含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为ρ，按式（3）根据稀释倍数和称样量计算出试样中烟酸（或烟酰胺）的含量。
12.3.2 微孔板培养法
12.3.2.1标准曲线系列离心管
将烟酸标准曲线工作液在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中，按表3制备3套标准曲线系列离心管。未接种空白孔（UN）、接种空白孔（IN）、S1~S8中烟酸（或烟酰胺）质量浓度与试管法相同。
image.png
12.3.2.2试样系列离心管
将稀释后的试样提取液（12.2.4）无菌条件下过滤除菌，按表4制备3套试样系列离心管。
image.png
12.3.2.3接 种和培养
烟酸测定培养基灭菌冷却后（或者无菌条件下过滤除菌），每10 mL培养基中加入测试菌悬液（12.1.3）100μL~200μL，混匀，吸取150μL加入微孔板中。UN（未接种空白）使用未加入菌悬液的培养基。从标准曲线系列离心管和试样系列离心管吸取150μL加入微孔板中，覆膜，置于恒温培养箱中，36℃±1℃下培养18 h~24 h。
12.3.2.4测定
培养结束后，对每个孔进行目测检查，未接种空白孔（UN）内培养液应是澄清的，否则测定无效。标准曲线孔和试样孔中培养液的吸光度应有梯度差别。将微孔板置于酶标仪内，540nm~550nm（或者610 nm~630 nm）选择稳定波长进行比色。
记录比色后的吸光度，数据处理同试管培养法12.3.1.6.2 和12.3.1.6.3。计算全部编号试样孔的总平均值为ρ，按式（3）根据稀释倍数和称样量计算出试样中烟酸（或烟酰胺）的含量。
注：也可使用与本标准检测原理相同且经等效验证的烟酸和烟酰胺检测试剂盒。
13分析结果的表述
试样中烟酸（或烟酰胺）含量按式（3）计算。
image.png
式中：
X——试样中烟酸（或烟酰胺）含量，单位为微克每百克（μg/100 g）或微克每百毫升（μg/100 mL）；
ρ——试样提取稀释液中烟酸（或烟酰胺）质量浓度的总平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样提取液的定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）；
V1——过滤前的定容体积，单位为毫升（mL）；
V2——过滤后吸取滤液的体积，单位为毫升（mL）；
f——试样提取液稀释倍数；
image.png——换算系数。
计算结果保留3位有效数字。
注1：对于特殊用途饮料等不经处理直接定容的样品，式中去除V1和V2。
注2：如果用烟酸标准品配制标准溶液，测定结果则以烟酸计；如果用烟酰胺标准品配制标准溶液，测定结果以烟酰胺计。
注3：烟酰胺的结果乘以换算系数1.008，可以转化为烟酸的结果。
注4：如果样品中烟酸（或烟酰胺）含量较高，可适当进一步稀释；如果含量较低，可适当提高样品称样量或降低稀释倍数。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
15其他
15.1需要提取的样品：当称样量为2 g，本标准定量限为1 250 μg/100 g。
15.2特殊用途饮料 等不经12.2.3 步骤处理直接定容的样品：当称样量为10 g时，定量限为5 μg/100 g。
GB 5009.89-2023
食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定 第二法
（转载自：https://t.cn/A6TdcCWM）
前言
本标准代替GB 5009.89-2016《食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定》。
本标准与GB 5009.89-2016相比，主要变化如下：
——高效液相色谱法调整为第一法，微生物法调整为第二法；
——增加了第二法 微生物法中的微孔板法、试样处理后调节pH的要求；
——修改了第二法 微生物法的标准曲线浓度范围、精密度和定量限。
1范围
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法适用于调制乳粉、特殊膳食用食品（不包括乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方以及氨基酸代谢障碍配方的特殊医学用途婴儿配方食品）和特殊用途饮料中烟酸和烟酰胺的测定，第二法适用于食品中烟酸（或烟酰胺）的测定。
第二法 微生物法
9原理
烟酸和烟酰胺是植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）生长所必需的营养素，在烟酸测定培养基中，植物乳植杆菌的生长与烟酸（或烟酰胺）的含量呈相关性，根据烟酸（或烟酰胺）含量与透光率（或吸光度）的标准曲线计算出试样中烟酸（或烟酰胺）含量。
10试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水或二级水。
10.1菌株
植物乳植杆菌（ Lactiplantiacillus plantarum ）（原植物乳杆菌， Lactobacillus plantarum ）ATCC 8014或等效菌株。
10.2 培养基
10.2.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录B中B.1。
10.2.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录 B中B.2。
10.2.3烟酸测定用培养基：见附录B中 B.3。
注：可使用商品化的合成培养基，按照说明书操作。
10.3试剂
10.3.1 无水乙醇（C2H5OH）。
10.3.2硫酸（H2SO4）：95%~98%。
10.3.3氢氧化钠（NaOH）。
10.3.4氯化钠（NaCl）。
10.4试剂配制
10.4.1乙醇溶液（体积分数为25%）：量取250 mL无水乙醇，加水定容至1 000 mL。
10.4.2硫酸溶液 A（10 mol/L）：量取560 mL硫酸，加入水中，稀释至1 000 mL。
10.4.3硫酸溶液 B（0.5 mol/L）：量取50 mL硫酸溶液A（10 mol/L） ，加入水中，稀释至1 000 mL。
10.4.4氢氧化钠溶液 A（10 mol/L）：称取400 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 000 mL。
10.4.5氢氧化钠溶液 B（0.1 mol/L）：吸取10 mL氢氧化钠溶液A（10 mol/L）， 加水稀释至1 000 mL。
10.4.6无菌生理盐水（8.5 g/L）：称取8.5 g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，分装于具塞试管，每管10 mL， 121℃高压灭菌15 min。
10.5标准品
10.5.1烟酸（C6H5NO2，CAS号：59-67-6） ：纯度≥98% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.5.2烟酰胺（C6H6N2O，CAS号：98-92-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.6标准溶液配制
10.6.1烟酸（或烟酰胺）标准储备液（50 μg/mL）：将烟酸（或烟酰胺）标准品置于含五氧化二磷的干燥器中，干燥过夜。按纯度称取，使烟酸（或烟酰胺）含量为50.0 mg（精确至0.001 g） ，用乙醇溶液（25%）溶解移入1000mL容量瓶，定容至刻度。
10.6.2烟酸（或烟酰胺）标准中间液（500ng/mL）：吸取1.0mL烟酸（或烟酰胺）标准储备液（50μg/mL）至100mL容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容至刻度。
10.6.3烟酸（或烟酰胺）标准工作液：分两个质量浓度，高质量浓度溶液的质量浓度为10ng/mL；低质量浓度溶液的质量浓度为5ng/mL。从中间液中（500ng/mL）吸取2次，各2mL，分别移入100mL和200mL容量瓶，用水定容至刻度。
注：配制标准溶液使用棕色容量瓶，配制后的标准溶液要用棕色试剂瓶2℃~8℃冷藏于冰箱内。标准储备液和中间液保存期6个月，标准使用液临用现配。
11仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
11.1 分析天平：感量为0.1 mg。
11.2 离心机。
11.3 涡旋混合器。
11.4 pH计：精度为0.01。
11.5 恒温培养箱：36℃±1℃。
11.6 分光光度计：540 nm~660 nm。
1.7 酶标仪：540 nm~660 nm。
11.8 冰箱：2℃~8℃。
11.9 无菌微孔板。
11.10 定量滤纸：直径90 mm。
11.11 试管：18 mm×180 mm。
11.12 容量瓶：容量100 mL、200 mL、250 mL、500 mL。
11.13 单刻度移液管：1 mL、5 mL、10 mL。
11.14 刻度吸管：5 mL（具0.1 mL刻度）。
11.15 玻璃漏斗：直径100 mm。
11.16 锥形瓶：容量250 mL。
11.17 烧杯：容量100 mL。
11.18 分液器：0 mL~10 mL。
11.19 微量移液器：1 000 μL，200 μL。
11.20 无菌离心管：1.5 mL。
11.21 针头过滤器：孔径0.22 μm。
注：清洗后的玻璃器皿和金属器具应在250℃下干热1 h~2 h。
12 分析步骤
12.1测试菌悬液制备
12.1.1 将植物乳植杆菌菌株活化后，用接种针穿刺接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36℃±1℃培养16 h~24 h，再转种2代~3代以增强活力。以斜面培养物方式置冰箱冷藏，可保存1个月。
12.1.2 将24 h内活化后的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，36℃±1℃培养16 h~24 h。以3 000 r/min~5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL生理盐水，用涡旋混合器振荡该悬液，再离心约5 min，弃去上清液。如前操作清洗2次~3次后，再加10 mL生理盐水，振荡混匀。吸取适量该菌悬液于10mL生理盐水中，混匀制成测试菌悬液。
12.1.3 以生理盐水做空白，用分光光度计于550 nm波长下测定测试菌悬液透光率（%T），调整上述菌液加入量，使测试菌悬液透光率在60%T ~80%T。
12.2试样提取
块状、颗粒状试样需粉碎；乳粉、米粉等粉状试样需混匀；果蔬、肉、蛋、鱼、动物内脏等需制成食糜；半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。
12.2.1固态试样：准确称取（精确至0.001 g）试样于锥形瓶中，其中新鲜果蔬试样2 g~5 g；谷类、豆类、坚果类、内脏生肉、干制试样0.2 g~1 g；乳粉、米粉等试样2 g~3g；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1 g~0.5 g；其他食品0.2 g~1 g。
12.2.2液体饮料或流质、半流质试样：称取5g~10g（精确至0.001g）（或用单刻度移液管吸取适量体积）于锥形瓶中。特殊用途饮料称取样品后不需按12.2.3 进行处理，称样后直接定容至100 mL（V）后，按12.2.4进行稀释。
如果试样烟酸（或烟酰胺）含量过低，可适当提高称样量。
12.2.3加入试样质量（以克计）10倍的硫酸溶液B（以毫升计），将上述混合物放入压力蒸汽灭菌器，121℃下水解30 min，取出迅速水浴冷却至室温。用氢氧化钠溶液A和氢氧化钠溶液B调节pH至4.5±0.2，移入250 mL（V）容量瓶中，用水定容至刻度。
用定量滤纸过滤，最初约10 mL滤液应弃去，吸取5 mL（V2）滤液于100 mL烧杯中，加水约20 mL，用氢氧化钠溶液B调节pH至6.8±0.2，移入100 mL（V）容量瓶中加水定容至刻度。
12.2.4稀释：根据试样中烟酸（或烟酰胺）含量用水对提取液进行适当稀释，使稀释后试样提取液中烟酸（或烟酰胺）质量浓度为5 ng/mL~12 ng/mL。
12.3 试样测定
12.3.1 试管培养法
12.3.1.1 标准曲线系列管
按表1顺序加入水、标准曲线工作液和烟酸测定用培养基至培养试管中，表1中每一编号需制作3管。未接种空白试管（UN）、 接种空白试管（IN）、标准系列管S1~S8中烟酸（或烟酰胺）质量浓度分别为0 ng、0 ng、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/ mL、25 ng/ mL、30 ng/ mL、40 ng/mL、50 ng/ mL。
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12.3.1.2试样系列管
按表2顺序加入水、试样提取液和烟酸测定用培养基至培养试管中，表中每一编号需制作3管。
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12.3.1.3 灭菌
将标准曲线系列管和试样系列管放入压力蒸汽灭菌器，121℃下灭菌5 min（商品培养基按标签说明进行灭菌），取出后迅速用水浴冷却到室温。为了保证加热和冷却过程中温度均匀，灭菌试管不应距离灭菌器内壁过近，试管摆放不应过密，以免影响空气流通。
12.3.1.4 接种
在无菌条件下，向.上述每管中（标准曲线未接种空白管UN除外）各加入1滴（50μL~ 100 μL）测试菌液，加盖，充分振荡混匀所有培养管。
12.3.1.5培养
将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃下培养18 h~24 h。
12.3.1.6测定
培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种空白试管（UN）内培养液应是澄清的，标准曲线系列管和试样系列管中培养液的吸光度应有梯度差别。未接种空白试管（UN）若混浊，则测定无效。
12.3.1.6.1用未接种空白试管（UN）作空白，将分光光度计透光率调至100%T ，读出接种空白试管（IN）的读数。再以接种空白试管（IN）为空白，调节透光率为100%T ，依次读出其他试管的透光率（%T） （或吸光度A）。
12.3.1.6.2用涡旋混合器充分混合每一支试管（也可以加一-滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内，在550 nm波长下进行比色。待读数稳定后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。依次读出其他试管的透光率。透光率超出标准曲线管S1~S8覆盖的浓度范围的培养管要舍去。以烟酸或烟酰胺标准品的质量浓度为横坐标，透光率为纵坐标绘制标准曲线。
注：绘制标准曲线，也可以吸光度A作纵坐标。
12.3.1.6.3对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率或吸光度计算每毫升试样提取液中烟酸（或烟酰胺）的浓度，并计算该编号提取液的烟酸（或烟酰胺）浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15% ：超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有4个编号提取液总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数不少于原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升提取液中烟酸（或烟酰胺）含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为ρ，按式（3）根据稀释倍数和称样量计算出试样中烟酸（或烟酰胺）的含量。
12.3.2 微孔板培养法
12.3.2.1标准曲线系列离心管
将烟酸标准曲线工作液在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中，按表3制备3套标准曲线系列离心管。未接种空白孔（UN）、接种空白孔（IN）、S1~S8中烟酸（或烟酰胺）质量浓度与试管法相同。
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12.3.2.2试样系列离心管
将稀释后的试样提取液（12.2.4）无菌条件下过滤除菌，按表4制备3套试样系列离心管。
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12.3.2.3接 种和培养
烟酸测定培养基灭菌冷却后（或者无菌条件下过滤除菌），每10 mL培养基中加入测试菌悬液（12.1.3）100μL~200μL，混匀，吸取150μL加入微孔板中。UN（未接种空白）使用未加入菌悬液的培养基。从标准曲线系列离心管和试样系列离心管吸取150μL加入微孔板中，覆膜，置于恒温培养箱中，36℃±1℃下培养18 h~24 h。
12.3.2.4测定
培养结束后，对每个孔进行目测检查，未接种空白孔（UN）内培养液应是澄清的，否则测定无效。标准曲线孔和试样孔中培养液的吸光度应有梯度差别。将微孔板置于酶标仪内，540nm~550nm（或者610 nm~630 nm）选择稳定波长进行比色。
记录比色后的吸光度，数据处理同试管培养法12.3.1.6.2 和12.3.1.6.3。计算全部编号试样孔的总平均值为ρ，按式（3）根据稀释倍数和称样量计算出试样中烟酸（或烟酰胺）的含量。
注：也可使用与本标准检测原理相同且经等效验证的烟酸和烟酰胺检测试剂盒。
13分析结果的表述
试样中烟酸（或烟酰胺）含量按式（3）计算。
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式中：
X——试样中烟酸（或烟酰胺）含量，单位为微克每百克（μg/100 g）或微克每百毫升（μg/100 mL）；
ρ——试样提取稀释液中烟酸（或烟酰胺）质量浓度的总平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——试样提取液的定容体积，单位为毫升（mL）；
m——试样的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）；
V1——过滤前的定容体积，单位为毫升（mL）；
V2——过滤后吸取滤液的体积，单位为毫升（mL）；
f——试样提取液稀释倍数；
image.png——换算系数。
计算结果保留3位有效数字。
注1：对于特殊用途饮料等不经处理直接定容的样品，式中去除V1和V2。
注2：如果用烟酸标准品配制标准溶液，测定结果则以烟酸计；如果用烟酰胺标准品配制标准溶液，测定结果以烟酰胺计。
注3：烟酰胺的结果乘以换算系数1.008，可以转化为烟酸的结果。
注4：如果样品中烟酸（或烟酰胺）含量较高，可适当进一步稀释；如果含量较低，可适当提高样品称样量或降低稀释倍数。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
15其他
15.1需要提取的样品：当称样量为2 g，本标准定量限为1 250 μg/100 g。
15.2特殊用途饮料 等不经12.2.3 步骤处理直接定容的样品：当称样量为10 g时，定量限为5 μg/100 g。
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