【#这些蔬菜嘌呤比肉还高#】这个tag是对的。而【#真正要忌口少吃的蔬菜#】这个tag则是错误的。
「有些蔬菜是隐藏的“嘌呤大户”，摄入过多也可能诱发尿酸升高，引起痛风发作。」这句话第一个半句是对的，但后面半句没有讲清楚针对的人群。同时，既然叙述了蔬菜，就应该把蔬菜的事情讲完整。
先说结论：
就目前证据而言，普通人群不必限制高嘌呤食物的摄入；高尿酸血症和痛风人群有条件地限制高嘌呤食物的摄入；同等嘌呤含量的条件下，蔬菜来源嘌呤对痛风复发带来的风险低于肉类来源嘌呤。
首先谈普通人群。医学上，任何一个推荐，都需要针对的人群。因为推荐需要根据证据。任何一篇临床研究文章，都要讲清楚自己的研究对象纳入了什么人，排除了什么人。对于没有高尿酸血症、没有痛风的人群，目前证据不支持普遍地限制高嘌呤食物的摄入。
对普通人群，重要的是均衡膳食、保持每周150分钟以上的中高强度运动、控制体重在健康范围。语焉不详的科普讲多了，只会徒增焦虑，模糊焦点。
然后谈痛风和高尿酸血症人群。
高尿酸血症是痛风的发病基础。痛风患者未用药时的血尿酸一定是高的；而血尿酸的数值高可能无症状，不痛风。
尿酸是嘌呤代谢的最终产物，所以人们长期以来认为应该在痛风和高尿酸血症人群中，限制嘌呤摄入。但是，目前确实没有足够强的证据显示，应该对高尿酸血症和痛风患者限制嘌呤摄入。现版本美国风湿病学会《痛风管理指南》为2020版，《中国循证医学杂志》对该版有过解读文章，文中这一段接近原《指南》的翻译（ 图1 ）：
「弱推荐痛风患者无论疾病是否活动都要限制嘌呤摄入量（证据质量：低）。」
其实，原文不是「弱推荐」，而是「有条件推荐」（ 图2 ）。
痛风患者人群中限制高嘌呤食物有意义吗？有。但是，一定要说清楚这个有条件推荐、低证据质量。因为，高嘌呤食物与其他措施所应对的负面因素（酒精、超重）不同，是有益处的。比如，即使鱼高嘌呤，但也要考虑到其带来丰富多样的营养成分，并不是「禁忌」。
那么，高嘌呤蔬菜呢？
医学界顶刊《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究（ 图3 ）显示，摄入高嘌呤蔬菜与新发痛风风险增加无关。
风湿病学顶刊《风湿病年鉴》上的另一项研究（ 图4 ）显示。动物来源嘌呤摄入量增加五分位数时，痛风患者的痛风复发相应的 OR 分别为 1.42、1.34、1.77 和 2.41；植物来源嘌呤摄入量增加五分位数时，相应 OR 分别为 1.12、0.99、1.32 和 1.39。OR是「比值比（Odds Ratio）」，定义上是暴露人数与非暴露人数的比值除以对照组中暴露人数与非暴露人数的比值。比如1.12就是相对非暴露（没摄入）人群提高了12%，0.99就是减少了1%。
显然，肉类来源嘌呤摄入对痛风患者的痛风复发影响更大（植物来源的嘌呤摄入甚至还有个OR值为0.99）。因此，这篇文章认为，避免或减少富含嘌呤食物的摄入量，尤其是动物源性食物，可能有助于降低痛风发作的风险。
实际上，在《中国高尿酸血症相关疾病诊疗多学科专家共识》中，给高尿酸血症患者的饮食建议里，「蔬菜」是直接放在「鼓励食用」那一栏的（ 图5 ）。发达国家的痛风临床实践中也存在类似推荐（DASH饮食，沿用自高血压干预）。这是因为，这样简洁的推荐对临床实践更有操作性。
最后重申结论：
就目前证据而言，普通人群不必限制高嘌呤食物的摄入，重要的是均衡膳食、保持每周150分钟以上的中高强度运动、控制体重在健康范围；
高尿酸血症和痛风人群有条件地限制高嘌呤食物的摄入；
同等嘌呤含量的条件下，蔬菜来源嘌呤对痛风复发带来的风险低于肉类来源嘌呤。
参考文献：
［1］李秀,张姬慧,聂英坤.2020年美国风湿病学会《痛风管理指南》解读[J].中国循证医学杂志, 2021,21(4):7.DOI:10.7507/1672-2531.202011118.
［2］American College of Rheumatology (ACR): Guideline for the management of gout 2020.
［3］Choi HK, Atkinson K, Karlson EW, Willett W, Curhan G. Purine-rich foods, dairy and protein intake, and the risk of gout in men. N Engl J Med. 2004 Mar 11;350(11):1093-103. doi: 10.1056/NEJMoa035700. PMID: 15014182.
［4］Zhang Y, Chen C, Choi H, Chaisson C, Hunter D, Niu J, Neogi T. Purine-rich foods intake and recurrent gout attacks. Ann Rheum Dis. 2012 Sep;71(9):1448-53. doi: 10.1136/annrheumdis-2011-201215. Epub 2012 May 30. PMID: 22648933; PMCID: PMC3889483.
［5］中国高尿酸血症相关疾病诊疗多学科
专家共识（2023年版）
「有些蔬菜是隐藏的“嘌呤大户”，摄入过多也可能诱发尿酸升高，引起痛风发作。」这句话第一个半句是对的，但后面半句没有讲清楚针对的人群。同时，既然叙述了蔬菜，就应该把蔬菜的事情讲完整。
先说结论：
就目前证据而言，普通人群不必限制高嘌呤食物的摄入；高尿酸血症和痛风人群有条件地限制高嘌呤食物的摄入；同等嘌呤含量的条件下，蔬菜来源嘌呤对痛风复发带来的风险低于肉类来源嘌呤。
首先谈普通人群。医学上，任何一个推荐，都需要针对的人群。因为推荐需要根据证据。任何一篇临床研究文章，都要讲清楚自己的研究对象纳入了什么人，排除了什么人。对于没有高尿酸血症、没有痛风的人群，目前证据不支持普遍地限制高嘌呤食物的摄入。
对普通人群，重要的是均衡膳食、保持每周150分钟以上的中高强度运动、控制体重在健康范围。语焉不详的科普讲多了，只会徒增焦虑，模糊焦点。
然后谈痛风和高尿酸血症人群。
高尿酸血症是痛风的发病基础。痛风患者未用药时的血尿酸一定是高的；而血尿酸的数值高可能无症状，不痛风。
尿酸是嘌呤代谢的最终产物，所以人们长期以来认为应该在痛风和高尿酸血症人群中，限制嘌呤摄入。但是，目前确实没有足够强的证据显示，应该对高尿酸血症和痛风患者限制嘌呤摄入。现版本美国风湿病学会《痛风管理指南》为2020版，《中国循证医学杂志》对该版有过解读文章，文中这一段接近原《指南》的翻译（ 图1 ）：
「弱推荐痛风患者无论疾病是否活动都要限制嘌呤摄入量（证据质量：低）。」
其实，原文不是「弱推荐」，而是「有条件推荐」（ 图2 ）。
痛风患者人群中限制高嘌呤食物有意义吗？有。但是，一定要说清楚这个有条件推荐、低证据质量。因为，高嘌呤食物与其他措施所应对的负面因素（酒精、超重）不同，是有益处的。比如，即使鱼高嘌呤，但也要考虑到其带来丰富多样的营养成分，并不是「禁忌」。
那么，高嘌呤蔬菜呢？
医学界顶刊《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究（ 图3 ）显示，摄入高嘌呤蔬菜与新发痛风风险增加无关。
风湿病学顶刊《风湿病年鉴》上的另一项研究（ 图4 ）显示。动物来源嘌呤摄入量增加五分位数时，痛风患者的痛风复发相应的 OR 分别为 1.42、1.34、1.77 和 2.41；植物来源嘌呤摄入量增加五分位数时，相应 OR 分别为 1.12、0.99、1.32 和 1.39。OR是「比值比（Odds Ratio）」，定义上是暴露人数与非暴露人数的比值除以对照组中暴露人数与非暴露人数的比值。比如1.12就是相对非暴露（没摄入）人群提高了12%，0.99就是减少了1%。
显然，肉类来源嘌呤摄入对痛风患者的痛风复发影响更大（植物来源的嘌呤摄入甚至还有个OR值为0.99）。因此，这篇文章认为，避免或减少富含嘌呤食物的摄入量，尤其是动物源性食物，可能有助于降低痛风发作的风险。
实际上，在《中国高尿酸血症相关疾病诊疗多学科专家共识》中，给高尿酸血症患者的饮食建议里，「蔬菜」是直接放在「鼓励食用」那一栏的（ 图5 ）。发达国家的痛风临床实践中也存在类似推荐（DASH饮食，沿用自高血压干预）。这是因为，这样简洁的推荐对临床实践更有操作性。
最后重申结论：
就目前证据而言，普通人群不必限制高嘌呤食物的摄入，重要的是均衡膳食、保持每周150分钟以上的中高强度运动、控制体重在健康范围；
高尿酸血症和痛风人群有条件地限制高嘌呤食物的摄入；
同等嘌呤含量的条件下，蔬菜来源嘌呤对痛风复发带来的风险低于肉类来源嘌呤。
参考文献：
［1］李秀,张姬慧,聂英坤.2020年美国风湿病学会《痛风管理指南》解读[J].中国循证医学杂志, 2021,21(4):7.DOI:10.7507/1672-2531.202011118.
［2］American College of Rheumatology (ACR): Guideline for the management of gout 2020.
［3］Choi HK, Atkinson K, Karlson EW, Willett W, Curhan G. Purine-rich foods, dairy and protein intake, and the risk of gout in men. N Engl J Med. 2004 Mar 11;350(11):1093-103. doi: 10.1056/NEJMoa035700. PMID: 15014182.
［4］Zhang Y, Chen C, Choi H, Chaisson C, Hunter D, Niu J, Neogi T. Purine-rich foods intake and recurrent gout attacks. Ann Rheum Dis. 2012 Sep;71(9):1448-53. doi: 10.1136/annrheumdis-2011-201215. Epub 2012 May 30. PMID: 22648933; PMCID: PMC3889483.
［5］中国高尿酸血症相关疾病诊疗多学科
专家共识（2023年版）
#Note# 尽管现有的商业银行资本框架过于宽松，但也足够产生约束力，所以规模达万亿美元的杠杆资金流入那些不受监管约束的非银行部门。对银行的监管规定更严格可以使银行更安全，但如果其他金融机构不受这些监管的约束，就会把风险引向金融体系的其他领域，超出银行安全网的覆盖范围，反而可能使整个金融体系更加脆弱。这是为银行和非银行设置不同的监管标准、碎片化的监管体系的矛盾和危险之处。美国资本监管框架最大的问题不是要求过松，而是覆盖太窄。抵押贷款资产质量最差、融资来源最不稳定的机构也是资本缓冲最少的机构，它们基本游离在监管体系之外。2005年，只有20%的次级按揭贷款是由受联邦监管的银行和储贷机构发放的。
监管规则应当更严格、更全面，监管部门应当更警觉、更主动。而且在经济繁荣时期就应当做出政治努力，以建立更有力的防线。但在繁荣时期，主流政治情绪不热衷于更加严格地落实现有银行监管规则，而且对监管体系的现代化改革和将监管延伸至非银行金融机构充满敌意。因为整个金融体系看起来有较强的风险抵御能力，所以危机前的争论重点在于是否应当进一步放松监管，而不是监管更严、覆盖更广。
不幸的是，如果没有一场危机来证明改革的必要性，改革是极难实现的。
【Bernanke,Ben S.(Editor) , Geithner,Timothy F.(Editor) , Paulson Jr.,Henry M.(Editor) , Liang,J. Nellie(Editor) . First Responders: Inside the U.S. Strategy for Fighting the 2007–2009 Global Financial Crisis本·伯南克、蒂莫西·盖特纳、亨利·保尔森、梁内利 编著/孙天琦、杨柳、赵冰喆 等 译《极速应对：美国应对2007—2009年全球金融危机背后的逻辑》，中信出版集团；图：《商海通牒》（Margin Call，2011）】
监管规则应当更严格、更全面，监管部门应当更警觉、更主动。而且在经济繁荣时期就应当做出政治努力，以建立更有力的防线。但在繁荣时期，主流政治情绪不热衷于更加严格地落实现有银行监管规则，而且对监管体系的现代化改革和将监管延伸至非银行金融机构充满敌意。因为整个金融体系看起来有较强的风险抵御能力，所以危机前的争论重点在于是否应当进一步放松监管，而不是监管更严、覆盖更广。
不幸的是，如果没有一场危机来证明改革的必要性，改革是极难实现的。
【Bernanke,Ben S.(Editor) , Geithner,Timothy F.(Editor) , Paulson Jr.,Henry M.(Editor) , Liang,J. Nellie(Editor) . First Responders: Inside the U.S. Strategy for Fighting the 2007–2009 Global Financial Crisis本·伯南克、蒂莫西·盖特纳、亨利·保尔森、梁内利 编著/孙天琦、杨柳、赵冰喆 等 译《极速应对：美国应对2007—2009年全球金融危机背后的逻辑》，中信出版集团；图：《商海通牒》（Margin Call，2011）】
走近科学前沿：生信分析和外膜囊泡为何引人瞩目？
本期为大家介绍一篇来自《Journal of Hazardous Materials》（IF=13.6）的文章，“Unveiling a novel mechanism for competitive advantage of ciprofloxacin-resistant bacteria in the environment through bacterial membrane vesicles”，涉及细菌外膜囊泡，为揭示细菌的耐药性以及在环境中的适应性生长和传播提供了全新的思路。
本文的主要内容是揭示了环境中耐环丙沙星细菌竞争优势的一个新机制，即通过细菌膜囊泡（BMVs）进行传递。研究发现，耐环丙沙星细菌产生的BMVs比敏感菌株产生的BMVs具有更丰富的蛋白质组成，并且这些差异表达的蛋白质主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和RNA降解等途径。进一步研究发现，耐环丙沙星细菌的BMVs能够与敏感菌株发生直接互作用，导致敏感菌株的破坏和内容物泄漏。
此外，研究还发现耐环丙沙星细菌的BMVs通过酸化敏感菌株的细胞内环境和调节细胞膜电位来增强对敏感菌株的抑制作用。研究结果揭示了耐药菌株通过BMVs传递的竞争优势机制，以及BMVs中的EcnB和酸性代谢产物在这一过程中的重要作用。
本文通过连续在低浓度头孢曲松（CIP）中培养，研究了CIP抗性大肠杆菌（CIP r）与敏感大肠杆菌（SEN）的竞争优势，使用共聚焦荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）等技术分析了CIP r产生的细菌膜泡（BMVs）对SEN的影响，然后通过蛋白质组学分析发现了与CIP抗性相关的关键蛋白质，如EcnB、AnsB、AldA、HslV、PurE和CopA，再研究了EcnB在CIP r中的作用以及其在CIP r -BMVs中的表达和代谢组学分析找到了CIP r -BMVs中具有抑制SEN作用的酸性代谢物。
这些实验揭示了CIP r在环境中的竞争优势及其与BMVs的关系，以及EcnB和酸性代谢物在CIP r -BMVs中的作用，为深入理解药物抗性及其在不同环境中的传播提供了新的认识。
CIPr（环丙沙星耐药菌）大肠杆菌比敏感性大肠杆菌（SEN:环丙沙星敏感菌）在竞争中更具有优势
为了模拟ARB在环境中低浓度抗生素条件下的形成，将SEN在亚MIC CIP存在的情况下连续传代，导致MIC增加了163倍，并产生了CIPr。生长曲线分析表明，与SEN相比，CIPr在稳定期的生长速度更慢，最终密度更低，这表明对长期CIP暴露产生了适应性（图 1A）。SEN的亚抑制浓度未达到最低限度杀菌浓度 （MBC），使 SEN 和耐药菌株共存一段时间。我们的竞争试验表明，CIPr菌株与SEN相比具有竞争优势（图1A）。
图 1 CIPr与SEN相比具有竞争优势。
BMV 赋予耐药细菌以竞争优势
在探索竞争机制时，作者发现来自 CIPr 培养的上清液（CIPr-SQ）能溶解 SEN 并抑制其生长，而来自 SEN 培养的上清液（SEN-SQ）则没有这种作用（图 1B）。作者重点研究了它们对 CIPr 抑制效果的影响。与 SEN 相比，CIPr 有更高浓度但更小直径的 BMVs（图 1C-F），这可能是适应长期抗生素压力的结果。随后的透射电镜（TEM）分析确认了大多数 BMVs 的直径大约在 15 到 150 纳米之间（图 1）。
向 SEN 培养物中添加 CIPr-BMVs 导致溶解和生长抑制，呈剂量依赖性（图 1G），而将 CIPr-BMVs 添加到 CIPr 或 SEN-BMVs 添加到任一菌株中均未显示出此类效果（图 1C-E）。此外，从多粘菌素抗性细菌中提取的 BMVs 也观察到了对 SEN 的类似抑制效果（图1F）。
这些发现表明 CIPr-BMVs 对 SEN 施加了细菌溶解作用，为 CIPr 提供了竞争优势。与其他已知传递抗性基因的 BMVs 不同，CIPr-BMVs 并未增加 SEN 的最小抑菌浓度（MIC），反而降低了其在 CIP 压力下的生存能力（图 1H）。以上结果表明，CIPr 的竞争优势不是由于 SEN 抗性增加，而是由于直接的细菌溶解作用。共聚焦荧光显微镜显示，DID标记的CIPr-BMVs或SEN-BMVs可以与DAPI标记的SEN融合（图2A），TEM分析进一步支持了CIPr的细菌溶解作用-BMVs 上
SEN，如膜破坏和内容物泄漏所观察到的（图 2B-C）。
图2 CIPr的-BMV 对 SEN 具有细菌溶解作用
BMV中的膜蛋白主要有助于竞争CIP的优势
为了进一步探索 CIPr-BMVs 成分对竞争的潜在影响，作者通过热处理 CIPr-BMVs 以失活其大部分成分。值得注意的是，100°C的热处理导致颗粒大小增加，浓度减少，并且失去了对 SEN 的致死效果（图 3A, D, H, I）。这表明负责竞争优势的关键分子对热失活敏感。此外，对 CIPr-BMVs 进行超声处理也导致了同样的结果（图 3B, E, H, I），表明 BMVs 的结构完整性在其功能中起着关键作用。
在随后的蛋白酶 K 消化实验中，作者观察到 CIPr-BMVs 对 SEN 的致死效果消失，这一效果通过添加蛋白酶 K 抑制剂部分恢复。而蛋白酶 K 和蛋白酶抑制剂本身不影响 BMVs 的颗粒大小和浓度（图 3C, F-I）。由于蛋白酶 K 能够降解表面蛋白而不破坏 BMVs 的膜结构，作者假设 CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制可能归因于 CIPr-BMVs 膜表面蛋白的存在。
图3 不同处理下的CIPr-BMVs对SEN的抑制作用
蛋白质组学分析可识别 CIP 耐药性的关键蛋白
基于数据独立获取（DIA）的定量蛋白质组学方法被用于阐明 SEN-BMVs 和 CIPr-BMVs 的蛋白质组成。这一分析显示 CIPr-BMVs 相较于 SEN-BMVs 有更多样的蛋白质谱，CIPr-BMVs 中鉴定到 1420 种蛋白质，而 SEN-BMVs 中为 624 种。
功率律全局误差模型（PLGEM）分析确认了作者蛋白质组数据的可靠性，皮尔森相关系数为 0.82，调整后的 r2 值为 0.977（图 2A-D）。比较两种 BMVs 类型共有的 561 种蛋白质，鉴定出 354 种差异表达蛋白质（DEPs），其中 159 种在 CIPr-BMVs 中上调，195 种下调（图 4A）。这些 DEPs 主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和 RNA 降解途径，根据 KEGG 分析（图 4B）。值得注意的是，33 种外膜蛋白差异表达，与在 CIPr 中观察到的 BMVs 增加产量一致（图 4C）。标记蛋白 FepA、LpoA、OmpA 和 BamA 的高丰度表明作者获得的 BMVs 高纯度。
为了深入探索 BMVs 蛋白与 CIP 抗性之间的关系，作者选择了 L-天冬酰胺酶（AnsB，上调 18.62 倍）和鸟氨酸氨甲酰转移酶亚基 F（ArgF，下调 117 倍）作为分别代表前十大上调和下调蛋白进行敲除验证（图 4D）。此外，利用 Cytohubba-DMNC（最大邻域组分密度），作者识别出乳醛脱氢酶（AldA，上调 8.25 倍）作为在排除与核糖体相关蛋白后差异蛋白 String 网络中排名最高的蛋白（图 4E）。最小抑制浓度（MIC）测试显示，上调蛋白 AldA 和 AnsB 的删除增加了 SEN 对 CIP 的敏感性（图 2E-F, 图 4F），而下调蛋白 ArgF 的删除则不影响对 CIP 的抗性（图 4F）。
图4 SEN-BMVs和CIPr-BMVs的蛋白质组学分析
在 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 中也注意到了独特的蛋白，CIPr-BMVs 展示了 859 种独特蛋白而 SEN-BMVs 有 63 种（图 5A），可能影响细菌竞争或对 CIP 抗性作出贡献。基因本体（GO）分析突出了 RNA 修改，特别是 RNA 甲基化的显著富集，包括 ncRNA 甲基化、rRNA 甲基化和 tRNA 甲基化（图 5B-C）。此外，针对编码 CIPr-BMVs 或 SEN-BMVs 独特蛋白的基因，包括 EcnB、HslV、PurE、CopA 和 YdhV，构建了敲除菌株。随后的 MIC 测量指出，与 SEN 相比，ΔhslV 和 ΔpurE 菌株显示对 CIP 的抗性降低，而 ΔcopA 表现出增加的抗性。在删除 ΔecnB 和 ΔydhV 基因的菌株中未观察到显著变化（图 5D）。
图5 通过分析 CIPr-BMV 或 SEN-BMV 中的独特蛋白质来鉴定 CIP 耐药相关蛋白和通路
EcnB 是 CIPr 中的关键竞争分子
在作者对 CIPr-BMVs 中独特蛋白的分析中，EcnB 成为这些蛋白中最丰富的蛋白，引起了作者的注意（图 6A）。EcnB 是一种已知具有细菌溶解性质的膜定位蛋白。西方印迹分析确认 EcnB 存在于 CIPr 上清液中，但不在 SEN 中，并且显示 CIPr-BMVs 中的 EcnB 水平高于 SEN-BMVs（图 6B）。然而，在 SEN 和 CIPr 的 100 kDa 超滤管（LC）的流出液中未发现 EcnB。RT-qPCR 进一步揭示了在 CIPr 中 ecnB 在转录水平上的上调，以及其负调控因子 ompR 和 envZ 的同时下调（图 6C）。
作者通过生成敲除株 ΔecnB-CIPr 进一步研究了 EcnB 在 CIP-BMVs 中的作用。生长曲线显示，ecnB 的敲减并不影响细菌生长（图 1A）。有趣的是，ecnB 的删除并未改变菌株对 CIP 的最小抑制浓度（MIC）（图 6D），表明 EcnB 对维持细菌 CIP 抗性不是必需的。然而，在 CIP 的亚抑制浓度下连续 14 代传代后，ΔecnB-SEN 相比于 SEN 的抗性发展速率显著较慢，MIC 倍数变化分别为 27.5 和 106.7（图 6E）。
从 CIPr-BMVs 和 ΔecnB-CIPr-BMVs 的 Nanosight 分析中发现，ecnB 敲除并未影响囊泡大小，但显著降低了囊泡浓度（图 6F-I）。ΔecnB-CIPr-BMVs 对 SEN 生存的影响与 CIPr-BMVs 相比被消除（图 6J）。在共培养竞争实验中，ΔecnB-CIPr 株失去了其对 SEN 的竞争优势（图 6K）。这一发现在使用 SV-HUC-1 的模拟宿主环境中得到了进一步验证。在宿主环境中，通过在 CIPr 中敲除 ecnB，消除了 CIPr 相对于 SEN 的竞争优势（图 6L）。
图6 EcnB是一个关键的竞争因素
CIPr-BMVs中的酸性代谢物增强对敏感菌株的抑制作用
代谢组学分析被用于识别 CIPr-BMVs 中能增强 EcnB 对 SEN 溶解活性的成分。这项分析，通过显著的组间差异和高模型鲁棒性，识别出 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 之间独特的代谢物谱（图 3A-B）。通过 P 值 < 0.05 和在投影中的变量重要性（VIP）> 1 定义的差异代谢物揭示了顺式十一碳二烯酸作为一个主要成分，可能影响 CIPr-BMVs 内的 pH 环境或它们与其他菌株的相互作用（图 3C-D）。和弦图显示差异代谢物主要来源于脂类和类脂分子（图 3E）。分析主要在 CIPr-BMVs 中发现上调的酸性代谢物（图 7A, 表 S3），表明通过酸化 SEN 增强了 EcnB 的抗菌活性。途径分析指示甘油磷脂、甘油和不饱和脂肪酸代谢的上调（图 7B）。蛋白质组数据与这些发现一致，显示与脂肪酸合成和代谢相关的蛋白增加（图 7C-D），与之前关于 CIP 抗性中脂肪酸代谢的研究一致。
作者进一步研究了 CIPr-BMVs 对 SEN 的 pH 和膜电位的影响。结果显示，SEN 的 pH 值下降，且在暴露于 CIPr-BMVs 时膜电位显著去极化（图 7E-F）。此外，CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制效果在更酸性条件下增强，在更碱性环境中减弱（图 7G-H）。然而，这种效果在 ΔecnB-CIPr-BMVs 中未观察到，强调了 EcnB 在此过程中的作用（图 7I）。
图7 CIPr-BMVs酸化SEN
研究结论：
在没有抗生素压力的情况下，CIPr展示出比敏感大肠杆菌（SEN）更强的竞争优势。
细菌膜泡（BMVs）使CIPr具有竞争优势。
膜定位的Entericidin B（EcnB）在CIPr的竞争优势和抗药性形成中发挥关键作用。
酸性代谢物在CIPr -BMVs中起到增强抑制SEN的作用。
这些发现揭示了CIPr在环境中的适应性生长和传播机制，为全面理解抗药性机制、抗药菌的传播和竞争提供了新的视角。
总结
本研究旨在了解CIPr 和SEN之间的竞争动态及其机制，特别是BMVs在抗药性形成和细菌竞争中的作用。通过电子显微镜、蛋白质组学和代谢组学分析BMVs，揭示了CIPr具有竞争优势的潜在机制，特别关注膜定位的Entericidin B（EcnB）在抗药性形成和细菌竞争中的作用。这项研究取得了对CIPr在环境背景下的适应性生长和传播的理解的突破性进展。
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本期为大家介绍一篇来自《Journal of Hazardous Materials》（IF=13.6）的文章，“Unveiling a novel mechanism for competitive advantage of ciprofloxacin-resistant bacteria in the environment through bacterial membrane vesicles”，涉及细菌外膜囊泡，为揭示细菌的耐药性以及在环境中的适应性生长和传播提供了全新的思路。
本文的主要内容是揭示了环境中耐环丙沙星细菌竞争优势的一个新机制，即通过细菌膜囊泡（BMVs）进行传递。研究发现，耐环丙沙星细菌产生的BMVs比敏感菌株产生的BMVs具有更丰富的蛋白质组成，并且这些差异表达的蛋白质主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和RNA降解等途径。进一步研究发现，耐环丙沙星细菌的BMVs能够与敏感菌株发生直接互作用，导致敏感菌株的破坏和内容物泄漏。
此外，研究还发现耐环丙沙星细菌的BMVs通过酸化敏感菌株的细胞内环境和调节细胞膜电位来增强对敏感菌株的抑制作用。研究结果揭示了耐药菌株通过BMVs传递的竞争优势机制，以及BMVs中的EcnB和酸性代谢产物在这一过程中的重要作用。
本文通过连续在低浓度头孢曲松（CIP）中培养，研究了CIP抗性大肠杆菌（CIP r）与敏感大肠杆菌（SEN）的竞争优势，使用共聚焦荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）等技术分析了CIP r产生的细菌膜泡（BMVs）对SEN的影响，然后通过蛋白质组学分析发现了与CIP抗性相关的关键蛋白质，如EcnB、AnsB、AldA、HslV、PurE和CopA，再研究了EcnB在CIP r中的作用以及其在CIP r -BMVs中的表达和代谢组学分析找到了CIP r -BMVs中具有抑制SEN作用的酸性代谢物。
这些实验揭示了CIP r在环境中的竞争优势及其与BMVs的关系，以及EcnB和酸性代谢物在CIP r -BMVs中的作用，为深入理解药物抗性及其在不同环境中的传播提供了新的认识。
CIPr（环丙沙星耐药菌）大肠杆菌比敏感性大肠杆菌（SEN:环丙沙星敏感菌）在竞争中更具有优势
为了模拟ARB在环境中低浓度抗生素条件下的形成，将SEN在亚MIC CIP存在的情况下连续传代，导致MIC增加了163倍，并产生了CIPr。生长曲线分析表明，与SEN相比，CIPr在稳定期的生长速度更慢，最终密度更低，这表明对长期CIP暴露产生了适应性（图 1A）。SEN的亚抑制浓度未达到最低限度杀菌浓度 （MBC），使 SEN 和耐药菌株共存一段时间。我们的竞争试验表明，CIPr菌株与SEN相比具有竞争优势（图1A）。
图 1 CIPr与SEN相比具有竞争优势。
BMV 赋予耐药细菌以竞争优势
在探索竞争机制时，作者发现来自 CIPr 培养的上清液（CIPr-SQ）能溶解 SEN 并抑制其生长，而来自 SEN 培养的上清液（SEN-SQ）则没有这种作用（图 1B）。作者重点研究了它们对 CIPr 抑制效果的影响。与 SEN 相比，CIPr 有更高浓度但更小直径的 BMVs（图 1C-F），这可能是适应长期抗生素压力的结果。随后的透射电镜（TEM）分析确认了大多数 BMVs 的直径大约在 15 到 150 纳米之间（图 1）。
向 SEN 培养物中添加 CIPr-BMVs 导致溶解和生长抑制，呈剂量依赖性（图 1G），而将 CIPr-BMVs 添加到 CIPr 或 SEN-BMVs 添加到任一菌株中均未显示出此类效果（图 1C-E）。此外，从多粘菌素抗性细菌中提取的 BMVs 也观察到了对 SEN 的类似抑制效果（图1F）。
这些发现表明 CIPr-BMVs 对 SEN 施加了细菌溶解作用，为 CIPr 提供了竞争优势。与其他已知传递抗性基因的 BMVs 不同，CIPr-BMVs 并未增加 SEN 的最小抑菌浓度（MIC），反而降低了其在 CIP 压力下的生存能力（图 1H）。以上结果表明，CIPr 的竞争优势不是由于 SEN 抗性增加，而是由于直接的细菌溶解作用。共聚焦荧光显微镜显示，DID标记的CIPr-BMVs或SEN-BMVs可以与DAPI标记的SEN融合（图2A），TEM分析进一步支持了CIPr的细菌溶解作用-BMVs 上
SEN，如膜破坏和内容物泄漏所观察到的（图 2B-C）。
图2 CIPr的-BMV 对 SEN 具有细菌溶解作用
BMV中的膜蛋白主要有助于竞争CIP的优势
为了进一步探索 CIPr-BMVs 成分对竞争的潜在影响，作者通过热处理 CIPr-BMVs 以失活其大部分成分。值得注意的是，100°C的热处理导致颗粒大小增加，浓度减少，并且失去了对 SEN 的致死效果（图 3A, D, H, I）。这表明负责竞争优势的关键分子对热失活敏感。此外，对 CIPr-BMVs 进行超声处理也导致了同样的结果（图 3B, E, H, I），表明 BMVs 的结构完整性在其功能中起着关键作用。
在随后的蛋白酶 K 消化实验中，作者观察到 CIPr-BMVs 对 SEN 的致死效果消失，这一效果通过添加蛋白酶 K 抑制剂部分恢复。而蛋白酶 K 和蛋白酶抑制剂本身不影响 BMVs 的颗粒大小和浓度（图 3C, F-I）。由于蛋白酶 K 能够降解表面蛋白而不破坏 BMVs 的膜结构，作者假设 CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制可能归因于 CIPr-BMVs 膜表面蛋白的存在。
图3 不同处理下的CIPr-BMVs对SEN的抑制作用
蛋白质组学分析可识别 CIP 耐药性的关键蛋白
基于数据独立获取（DIA）的定量蛋白质组学方法被用于阐明 SEN-BMVs 和 CIPr-BMVs 的蛋白质组成。这一分析显示 CIPr-BMVs 相较于 SEN-BMVs 有更多样的蛋白质谱，CIPr-BMVs 中鉴定到 1420 种蛋白质，而 SEN-BMVs 中为 624 种。
功率律全局误差模型（PLGEM）分析确认了作者蛋白质组数据的可靠性，皮尔森相关系数为 0.82，调整后的 r2 值为 0.977（图 2A-D）。比较两种 BMVs 类型共有的 561 种蛋白质，鉴定出 354 种差异表达蛋白质（DEPs），其中 159 种在 CIPr-BMVs 中上调，195 种下调（图 4A）。这些 DEPs 主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和 RNA 降解途径，根据 KEGG 分析（图 4B）。值得注意的是，33 种外膜蛋白差异表达，与在 CIPr 中观察到的 BMVs 增加产量一致（图 4C）。标记蛋白 FepA、LpoA、OmpA 和 BamA 的高丰度表明作者获得的 BMVs 高纯度。
为了深入探索 BMVs 蛋白与 CIP 抗性之间的关系，作者选择了 L-天冬酰胺酶（AnsB，上调 18.62 倍）和鸟氨酸氨甲酰转移酶亚基 F（ArgF，下调 117 倍）作为分别代表前十大上调和下调蛋白进行敲除验证（图 4D）。此外，利用 Cytohubba-DMNC（最大邻域组分密度），作者识别出乳醛脱氢酶（AldA，上调 8.25 倍）作为在排除与核糖体相关蛋白后差异蛋白 String 网络中排名最高的蛋白（图 4E）。最小抑制浓度（MIC）测试显示，上调蛋白 AldA 和 AnsB 的删除增加了 SEN 对 CIP 的敏感性（图 2E-F, 图 4F），而下调蛋白 ArgF 的删除则不影响对 CIP 的抗性（图 4F）。
图4 SEN-BMVs和CIPr-BMVs的蛋白质组学分析
在 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 中也注意到了独特的蛋白，CIPr-BMVs 展示了 859 种独特蛋白而 SEN-BMVs 有 63 种（图 5A），可能影响细菌竞争或对 CIP 抗性作出贡献。基因本体（GO）分析突出了 RNA 修改，特别是 RNA 甲基化的显著富集，包括 ncRNA 甲基化、rRNA 甲基化和 tRNA 甲基化（图 5B-C）。此外，针对编码 CIPr-BMVs 或 SEN-BMVs 独特蛋白的基因，包括 EcnB、HslV、PurE、CopA 和 YdhV，构建了敲除菌株。随后的 MIC 测量指出，与 SEN 相比，ΔhslV 和 ΔpurE 菌株显示对 CIP 的抗性降低，而 ΔcopA 表现出增加的抗性。在删除 ΔecnB 和 ΔydhV 基因的菌株中未观察到显著变化（图 5D）。
图5 通过分析 CIPr-BMV 或 SEN-BMV 中的独特蛋白质来鉴定 CIP 耐药相关蛋白和通路
EcnB 是 CIPr 中的关键竞争分子
在作者对 CIPr-BMVs 中独特蛋白的分析中，EcnB 成为这些蛋白中最丰富的蛋白，引起了作者的注意（图 6A）。EcnB 是一种已知具有细菌溶解性质的膜定位蛋白。西方印迹分析确认 EcnB 存在于 CIPr 上清液中，但不在 SEN 中，并且显示 CIPr-BMVs 中的 EcnB 水平高于 SEN-BMVs（图 6B）。然而，在 SEN 和 CIPr 的 100 kDa 超滤管（LC）的流出液中未发现 EcnB。RT-qPCR 进一步揭示了在 CIPr 中 ecnB 在转录水平上的上调，以及其负调控因子 ompR 和 envZ 的同时下调（图 6C）。
作者通过生成敲除株 ΔecnB-CIPr 进一步研究了 EcnB 在 CIP-BMVs 中的作用。生长曲线显示，ecnB 的敲减并不影响细菌生长（图 1A）。有趣的是，ecnB 的删除并未改变菌株对 CIP 的最小抑制浓度（MIC）（图 6D），表明 EcnB 对维持细菌 CIP 抗性不是必需的。然而，在 CIP 的亚抑制浓度下连续 14 代传代后，ΔecnB-SEN 相比于 SEN 的抗性发展速率显著较慢，MIC 倍数变化分别为 27.5 和 106.7（图 6E）。
从 CIPr-BMVs 和 ΔecnB-CIPr-BMVs 的 Nanosight 分析中发现，ecnB 敲除并未影响囊泡大小，但显著降低了囊泡浓度（图 6F-I）。ΔecnB-CIPr-BMVs 对 SEN 生存的影响与 CIPr-BMVs 相比被消除（图 6J）。在共培养竞争实验中，ΔecnB-CIPr 株失去了其对 SEN 的竞争优势（图 6K）。这一发现在使用 SV-HUC-1 的模拟宿主环境中得到了进一步验证。在宿主环境中，通过在 CIPr 中敲除 ecnB，消除了 CIPr 相对于 SEN 的竞争优势（图 6L）。
图6 EcnB是一个关键的竞争因素
CIPr-BMVs中的酸性代谢物增强对敏感菌株的抑制作用
代谢组学分析被用于识别 CIPr-BMVs 中能增强 EcnB 对 SEN 溶解活性的成分。这项分析，通过显著的组间差异和高模型鲁棒性，识别出 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 之间独特的代谢物谱（图 3A-B）。通过 P 值 < 0.05 和在投影中的变量重要性（VIP）> 1 定义的差异代谢物揭示了顺式十一碳二烯酸作为一个主要成分，可能影响 CIPr-BMVs 内的 pH 环境或它们与其他菌株的相互作用（图 3C-D）。和弦图显示差异代谢物主要来源于脂类和类脂分子（图 3E）。分析主要在 CIPr-BMVs 中发现上调的酸性代谢物（图 7A, 表 S3），表明通过酸化 SEN 增强了 EcnB 的抗菌活性。途径分析指示甘油磷脂、甘油和不饱和脂肪酸代谢的上调（图 7B）。蛋白质组数据与这些发现一致，显示与脂肪酸合成和代谢相关的蛋白增加（图 7C-D），与之前关于 CIP 抗性中脂肪酸代谢的研究一致。
作者进一步研究了 CIPr-BMVs 对 SEN 的 pH 和膜电位的影响。结果显示，SEN 的 pH 值下降，且在暴露于 CIPr-BMVs 时膜电位显著去极化（图 7E-F）。此外，CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制效果在更酸性条件下增强，在更碱性环境中减弱（图 7G-H）。然而，这种效果在 ΔecnB-CIPr-BMVs 中未观察到，强调了 EcnB 在此过程中的作用（图 7I）。
图7 CIPr-BMVs酸化SEN
研究结论：
在没有抗生素压力的情况下，CIPr展示出比敏感大肠杆菌（SEN）更强的竞争优势。
细菌膜泡（BMVs）使CIPr具有竞争优势。
膜定位的Entericidin B（EcnB）在CIPr的竞争优势和抗药性形成中发挥关键作用。
酸性代谢物在CIPr -BMVs中起到增强抑制SEN的作用。
这些发现揭示了CIPr在环境中的适应性生长和传播机制，为全面理解抗药性机制、抗药菌的传播和竞争提供了新的视角。
总结
本研究旨在了解CIPr 和SEN之间的竞争动态及其机制，特别是BMVs在抗药性形成和细菌竞争中的作用。通过电子显微镜、蛋白质组学和代谢组学分析BMVs，揭示了CIPr具有竞争优势的潜在机制，特别关注膜定位的Entericidin B（EcnB）在抗药性形成和细菌竞争中的作用。这项研究取得了对CIPr在环境背景下的适应性生长和传播的理解的突破性进展。
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