总结出了7条铁律，字虽不多，但价值千金，分享给有缘人，看懂少走几年弯路！
1，什么是龙头？就是在多空双方不断的博弈中，走出的辨识度，本质上是情绪的载体。其背后往往具备一定的题材逻辑，强者恒强。一种观察方式，就是耐心等待调整，如果市场在大幅向下调整的时候，看看哪些是具备抵抗性的。比如板块中很多在深水区，但是龙头却是小幅震荡或调整，那么观察次日，一旦走强就是确认点。。
2，主线和支线。这两者的不同就在于，主线并非是一波流，而大多数支线只有一波就结束了。所以主流题材，大多可以走出三浪，时间上在一个半月到两个月之间。很多朋友往往一浪的时候后知后觉，但是实际上二浪的确定性更高，如果可以完成一波阶段高位箱体震荡，那么二浪的概率就大。
3，横盘震荡不研究。目前市场的数量大了，所以和之前的风格不一样，很多在低位横着不动的，甚至两三个月也没有一根阳线，很有可能是里面根本没有主控，不过是散户在里面自娱自乐罢了。所以耐心等待启动，不启动就不研究。
4，模式要纯粹，特别是短线。要不断揣摩市场合力的方向在哪，也就是阻力小的方向，而不是经常逆势，和市场对着干，这样太累了，也容易出问题。有句话说，人多的地方不去，这个也是分高位和低位而言的。如果没有人气，那么就没有泡沫带来的溢价。
5，长线的逻辑。中长线的逻辑并非是看业绩，而是看行业有没有扩容的预期，是否是从零到一的过程。而如果真的业绩兑现了，反而是个顶部。这里可以结合MACD这个技术指标来看，如果日线，周线和月线形成金叉，那么就是反转的信号。如果伴随着周线放量，跳空向上，往往走出一段行情。
6，关于执行。很多问题落实下来，就是执行的问题。认知好的朋友，有些也走不出来，一方面就是执行的时候往往犹豫。其实再差的系统，如果执行力强也一样可以走出来，怕就怕各种模式混合在一起，容易失去主心骨，那么就乱了。其次也要善于等待，因为不管是哪种模式，总有市场失灵的时候。
7，重势不重价。不管是向上还是向下，势能是散户朋友要研究的地方，而并不是一个点，也就是价。比如下行通道中，不断新低就是它的势，这个时候就要耐心等待这轮势能过去，直到反转信号的出现，比如金针探底，或者立地长阳形态的出现。
炒股就像是一场考试，而盈亏比就是考试的答案。每次做题之前，要从多方面考虑，比如是否符合模式，向上有多少，如果失败风险能否承受，这些点理清楚了，那么就不存在心态上的问题。
关注我，持续分享干货。如果觉得有所感悟，记得点赞收藏，祝大家周末愉快，股市长虹。
1，什么是龙头？就是在多空双方不断的博弈中，走出的辨识度，本质上是情绪的载体。其背后往往具备一定的题材逻辑，强者恒强。一种观察方式，就是耐心等待调整，如果市场在大幅向下调整的时候，看看哪些是具备抵抗性的。比如板块中很多在深水区，但是龙头却是小幅震荡或调整，那么观察次日，一旦走强就是确认点。。
2，主线和支线。这两者的不同就在于，主线并非是一波流，而大多数支线只有一波就结束了。所以主流题材，大多可以走出三浪，时间上在一个半月到两个月之间。很多朋友往往一浪的时候后知后觉，但是实际上二浪的确定性更高，如果可以完成一波阶段高位箱体震荡，那么二浪的概率就大。
3，横盘震荡不研究。目前市场的数量大了，所以和之前的风格不一样，很多在低位横着不动的，甚至两三个月也没有一根阳线，很有可能是里面根本没有主控，不过是散户在里面自娱自乐罢了。所以耐心等待启动，不启动就不研究。
4，模式要纯粹，特别是短线。要不断揣摩市场合力的方向在哪，也就是阻力小的方向，而不是经常逆势，和市场对着干，这样太累了，也容易出问题。有句话说，人多的地方不去，这个也是分高位和低位而言的。如果没有人气，那么就没有泡沫带来的溢价。
5，长线的逻辑。中长线的逻辑并非是看业绩，而是看行业有没有扩容的预期，是否是从零到一的过程。而如果真的业绩兑现了，反而是个顶部。这里可以结合MACD这个技术指标来看，如果日线，周线和月线形成金叉，那么就是反转的信号。如果伴随着周线放量，跳空向上，往往走出一段行情。
6，关于执行。很多问题落实下来，就是执行的问题。认知好的朋友，有些也走不出来，一方面就是执行的时候往往犹豫。其实再差的系统，如果执行力强也一样可以走出来，怕就怕各种模式混合在一起，容易失去主心骨，那么就乱了。其次也要善于等待，因为不管是哪种模式，总有市场失灵的时候。
7，重势不重价。不管是向上还是向下，势能是散户朋友要研究的地方，而并不是一个点，也就是价。比如下行通道中，不断新低就是它的势，这个时候就要耐心等待这轮势能过去，直到反转信号的出现，比如金针探底，或者立地长阳形态的出现。
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抓住流量红利：广告电商模式引领企业新发展
小编介绍：微三云集团邓恒，10年软件研发经验，专注模式设计，系统开发，为企业量身定制解决方案，公司在广东东莞，200+技术团队 专注软件开发行业10年多。
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上市孵化器
随着互联网电商的蓬勃发展，众多企业纷纷涉足这一领域，以捕捉不断增长的流量和市场份额。在这其中，一些企业凭借出色的品牌口碑和消费者体验优化，成功引领行业潮流。然而，面对瞬息万变的商业环境，如何准确把握流量的发展趋势，选择适合自身企业和产品的商业模式，成为了摆在企业面前的重要课题。
近年来，一种名为“广告电商”的商业模式备受瞩目。它巧妙地将社交电商与广告分佣相结合，为消费者带来了全新的购物体验。在这种模式下，消费者不仅可以通过购物获得积分，还能通过观看平台对接的广告任务，将积分变现并获得广告奖励。这种模式的出现，无疑为消费者、平台和广告主之间搭建了一座共赢的桥梁。
广告电商模式的魅力在于其创新性与共赢性的完美结合。它充分利用了互联网技术的优势，将广告板块与电商平台深度融合，实现了三方利益的最大化。对于消费者而言，他们可以在享受购物乐趣的同时，通过观看广告任务赚取积分，实现积分变现或享受更多优惠；对于平台而言，通过提供广告展示位和数据分析服务，可以获得广告主的投放费用，进一步提升用户粘性和活跃度；而对于广告主而言，他们可以通过精准投放广告，实现品牌曝光、产品推广和销售目标。
购物积分与广告任务的结合是其中的一大亮点。消费者在平台上购物时，可以获得相应积分，这些积分不仅可用于抵扣现金，还可通过观看广告任务进行变现。此外，社交分享与广告裂变也是该模式的重要玩法之一。平台鼓励消费者将广告活动分享至社交媒体平台，通过社交裂变的方式扩大广告的传播范围，从而吸引更多潜在消费者参与活动。这种玩法不仅激发了消费者的分享热情，也提升了广告的传播效果。
总之，广告电商模式以其独特的玩法和创新理念，实现了消费者、平台和广告主之间的共赢。随着技术的不断进步和市场的不断发展，这种模式还将继续创新和完善，为电商行业注入更多的活力和创新力。相信在不久的将来，广告电商模式将成为电商领域的一股重要力量，引领行业走向更加繁荣的未来。 #app开发 #电商运营干货
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走近科学前沿：生信分析和外膜囊泡为何引人瞩目？
本期为大家介绍一篇来自《Journal of Hazardous Materials》（IF=13.6）的文章，“Unveiling a novel mechanism for competitive advantage of ciprofloxacin-resistant bacteria in the environment through bacterial membrane vesicles”，涉及细菌外膜囊泡，为揭示细菌的耐药性以及在环境中的适应性生长和传播提供了全新的思路。
本文的主要内容是揭示了环境中耐环丙沙星细菌竞争优势的一个新机制，即通过细菌膜囊泡（BMVs）进行传递。研究发现，耐环丙沙星细菌产生的BMVs比敏感菌株产生的BMVs具有更丰富的蛋白质组成，并且这些差异表达的蛋白质主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和RNA降解等途径。进一步研究发现，耐环丙沙星细菌的BMVs能够与敏感菌株发生直接互作用，导致敏感菌株的破坏和内容物泄漏。
此外，研究还发现耐环丙沙星细菌的BMVs通过酸化敏感菌株的细胞内环境和调节细胞膜电位来增强对敏感菌株的抑制作用。研究结果揭示了耐药菌株通过BMVs传递的竞争优势机制，以及BMVs中的EcnB和酸性代谢产物在这一过程中的重要作用。
本文通过连续在低浓度头孢曲松（CIP）中培养，研究了CIP抗性大肠杆菌（CIP r）与敏感大肠杆菌（SEN）的竞争优势，使用共聚焦荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）等技术分析了CIP r产生的细菌膜泡（BMVs）对SEN的影响，然后通过蛋白质组学分析发现了与CIP抗性相关的关键蛋白质，如EcnB、AnsB、AldA、HslV、PurE和CopA，再研究了EcnB在CIP r中的作用以及其在CIP r -BMVs中的表达和代谢组学分析找到了CIP r -BMVs中具有抑制SEN作用的酸性代谢物。
这些实验揭示了CIP r在环境中的竞争优势及其与BMVs的关系，以及EcnB和酸性代谢物在CIP r -BMVs中的作用，为深入理解药物抗性及其在不同环境中的传播提供了新的认识。
CIPr（环丙沙星耐药菌）大肠杆菌比敏感性大肠杆菌（SEN:环丙沙星敏感菌）在竞争中更具有优势
为了模拟ARB在环境中低浓度抗生素条件下的形成，将SEN在亚MIC CIP存在的情况下连续传代，导致MIC增加了163倍，并产生了CIPr。生长曲线分析表明，与SEN相比，CIPr在稳定期的生长速度更慢，最终密度更低，这表明对长期CIP暴露产生了适应性（图 1A）。SEN的亚抑制浓度未达到最低限度杀菌浓度 （MBC），使 SEN 和耐药菌株共存一段时间。我们的竞争试验表明，CIPr菌株与SEN相比具有竞争优势（图1A）。
图 1 CIPr与SEN相比具有竞争优势。
BMV 赋予耐药细菌以竞争优势
在探索竞争机制时，作者发现来自 CIPr 培养的上清液（CIPr-SQ）能溶解 SEN 并抑制其生长，而来自 SEN 培养的上清液（SEN-SQ）则没有这种作用（图 1B）。作者重点研究了它们对 CIPr 抑制效果的影响。与 SEN 相比，CIPr 有更高浓度但更小直径的 BMVs（图 1C-F），这可能是适应长期抗生素压力的结果。随后的透射电镜（TEM）分析确认了大多数 BMVs 的直径大约在 15 到 150 纳米之间（图 1）。
向 SEN 培养物中添加 CIPr-BMVs 导致溶解和生长抑制，呈剂量依赖性（图 1G），而将 CIPr-BMVs 添加到 CIPr 或 SEN-BMVs 添加到任一菌株中均未显示出此类效果（图 1C-E）。此外，从多粘菌素抗性细菌中提取的 BMVs 也观察到了对 SEN 的类似抑制效果（图1F）。
这些发现表明 CIPr-BMVs 对 SEN 施加了细菌溶解作用，为 CIPr 提供了竞争优势。与其他已知传递抗性基因的 BMVs 不同，CIPr-BMVs 并未增加 SEN 的最小抑菌浓度（MIC），反而降低了其在 CIP 压力下的生存能力（图 1H）。以上结果表明，CIPr 的竞争优势不是由于 SEN 抗性增加，而是由于直接的细菌溶解作用。共聚焦荧光显微镜显示，DID标记的CIPr-BMVs或SEN-BMVs可以与DAPI标记的SEN融合（图2A），TEM分析进一步支持了CIPr的细菌溶解作用-BMVs 上
SEN，如膜破坏和内容物泄漏所观察到的（图 2B-C）。
图2 CIPr的-BMV 对 SEN 具有细菌溶解作用
BMV中的膜蛋白主要有助于竞争CIP的优势
为了进一步探索 CIPr-BMVs 成分对竞争的潜在影响，作者通过热处理 CIPr-BMVs 以失活其大部分成分。值得注意的是，100°C的热处理导致颗粒大小增加，浓度减少，并且失去了对 SEN 的致死效果（图 3A, D, H, I）。这表明负责竞争优势的关键分子对热失活敏感。此外，对 CIPr-BMVs 进行超声处理也导致了同样的结果（图 3B, E, H, I），表明 BMVs 的结构完整性在其功能中起着关键作用。
在随后的蛋白酶 K 消化实验中，作者观察到 CIPr-BMVs 对 SEN 的致死效果消失，这一效果通过添加蛋白酶 K 抑制剂部分恢复。而蛋白酶 K 和蛋白酶抑制剂本身不影响 BMVs 的颗粒大小和浓度（图 3C, F-I）。由于蛋白酶 K 能够降解表面蛋白而不破坏 BMVs 的膜结构，作者假设 CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制可能归因于 CIPr-BMVs 膜表面蛋白的存在。
图3 不同处理下的CIPr-BMVs对SEN的抑制作用
蛋白质组学分析可识别 CIP 耐药性的关键蛋白
基于数据独立获取（DIA）的定量蛋白质组学方法被用于阐明 SEN-BMVs 和 CIPr-BMVs 的蛋白质组成。这一分析显示 CIPr-BMVs 相较于 SEN-BMVs 有更多样的蛋白质谱，CIPr-BMVs 中鉴定到 1420 种蛋白质，而 SEN-BMVs 中为 624 种。
功率律全局误差模型（PLGEM）分析确认了作者蛋白质组数据的可靠性，皮尔森相关系数为 0.82，调整后的 r2 值为 0.977（图 2A-D）。比较两种 BMVs 类型共有的 561 种蛋白质，鉴定出 354 种差异表达蛋白质（DEPs），其中 159 种在 CIPr-BMVs 中上调，195 种下调（图 4A）。这些 DEPs 主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和 RNA 降解途径，根据 KEGG 分析（图 4B）。值得注意的是，33 种外膜蛋白差异表达，与在 CIPr 中观察到的 BMVs 增加产量一致（图 4C）。标记蛋白 FepA、LpoA、OmpA 和 BamA 的高丰度表明作者获得的 BMVs 高纯度。
为了深入探索 BMVs 蛋白与 CIP 抗性之间的关系，作者选择了 L-天冬酰胺酶（AnsB，上调 18.62 倍）和鸟氨酸氨甲酰转移酶亚基 F（ArgF，下调 117 倍）作为分别代表前十大上调和下调蛋白进行敲除验证（图 4D）。此外，利用 Cytohubba-DMNC（最大邻域组分密度），作者识别出乳醛脱氢酶（AldA，上调 8.25 倍）作为在排除与核糖体相关蛋白后差异蛋白 String 网络中排名最高的蛋白（图 4E）。最小抑制浓度（MIC）测试显示，上调蛋白 AldA 和 AnsB 的删除增加了 SEN 对 CIP 的敏感性（图 2E-F, 图 4F），而下调蛋白 ArgF 的删除则不影响对 CIP 的抗性（图 4F）。
图4 SEN-BMVs和CIPr-BMVs的蛋白质组学分析
在 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 中也注意到了独特的蛋白，CIPr-BMVs 展示了 859 种独特蛋白而 SEN-BMVs 有 63 种（图 5A），可能影响细菌竞争或对 CIP 抗性作出贡献。基因本体（GO）分析突出了 RNA 修改，特别是 RNA 甲基化的显著富集，包括 ncRNA 甲基化、rRNA 甲基化和 tRNA 甲基化（图 5B-C）。此外，针对编码 CIPr-BMVs 或 SEN-BMVs 独特蛋白的基因，包括 EcnB、HslV、PurE、CopA 和 YdhV，构建了敲除菌株。随后的 MIC 测量指出，与 SEN 相比，ΔhslV 和 ΔpurE 菌株显示对 CIP 的抗性降低，而 ΔcopA 表现出增加的抗性。在删除 ΔecnB 和 ΔydhV 基因的菌株中未观察到显著变化（图 5D）。
图5 通过分析 CIPr-BMV 或 SEN-BMV 中的独特蛋白质来鉴定 CIP 耐药相关蛋白和通路
EcnB 是 CIPr 中的关键竞争分子
在作者对 CIPr-BMVs 中独特蛋白的分析中，EcnB 成为这些蛋白中最丰富的蛋白，引起了作者的注意（图 6A）。EcnB 是一种已知具有细菌溶解性质的膜定位蛋白。西方印迹分析确认 EcnB 存在于 CIPr 上清液中，但不在 SEN 中，并且显示 CIPr-BMVs 中的 EcnB 水平高于 SEN-BMVs（图 6B）。然而，在 SEN 和 CIPr 的 100 kDa 超滤管（LC）的流出液中未发现 EcnB。RT-qPCR 进一步揭示了在 CIPr 中 ecnB 在转录水平上的上调，以及其负调控因子 ompR 和 envZ 的同时下调（图 6C）。
作者通过生成敲除株 ΔecnB-CIPr 进一步研究了 EcnB 在 CIP-BMVs 中的作用。生长曲线显示，ecnB 的敲减并不影响细菌生长（图 1A）。有趣的是，ecnB 的删除并未改变菌株对 CIP 的最小抑制浓度（MIC）（图 6D），表明 EcnB 对维持细菌 CIP 抗性不是必需的。然而，在 CIP 的亚抑制浓度下连续 14 代传代后，ΔecnB-SEN 相比于 SEN 的抗性发展速率显著较慢，MIC 倍数变化分别为 27.5 和 106.7（图 6E）。
从 CIPr-BMVs 和 ΔecnB-CIPr-BMVs 的 Nanosight 分析中发现，ecnB 敲除并未影响囊泡大小，但显著降低了囊泡浓度（图 6F-I）。ΔecnB-CIPr-BMVs 对 SEN 生存的影响与 CIPr-BMVs 相比被消除（图 6J）。在共培养竞争实验中，ΔecnB-CIPr 株失去了其对 SEN 的竞争优势（图 6K）。这一发现在使用 SV-HUC-1 的模拟宿主环境中得到了进一步验证。在宿主环境中，通过在 CIPr 中敲除 ecnB，消除了 CIPr 相对于 SEN 的竞争优势（图 6L）。
图6 EcnB是一个关键的竞争因素
CIPr-BMVs中的酸性代谢物增强对敏感菌株的抑制作用
代谢组学分析被用于识别 CIPr-BMVs 中能增强 EcnB 对 SEN 溶解活性的成分。这项分析，通过显著的组间差异和高模型鲁棒性，识别出 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 之间独特的代谢物谱（图 3A-B）。通过 P 值 < 0.05 和在投影中的变量重要性（VIP）> 1 定义的差异代谢物揭示了顺式十一碳二烯酸作为一个主要成分，可能影响 CIPr-BMVs 内的 pH 环境或它们与其他菌株的相互作用（图 3C-D）。和弦图显示差异代谢物主要来源于脂类和类脂分子（图 3E）。分析主要在 CIPr-BMVs 中发现上调的酸性代谢物（图 7A, 表 S3），表明通过酸化 SEN 增强了 EcnB 的抗菌活性。途径分析指示甘油磷脂、甘油和不饱和脂肪酸代谢的上调（图 7B）。蛋白质组数据与这些发现一致，显示与脂肪酸合成和代谢相关的蛋白增加（图 7C-D），与之前关于 CIP 抗性中脂肪酸代谢的研究一致。
作者进一步研究了 CIPr-BMVs 对 SEN 的 pH 和膜电位的影响。结果显示，SEN 的 pH 值下降，且在暴露于 CIPr-BMVs 时膜电位显著去极化（图 7E-F）。此外，CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制效果在更酸性条件下增强，在更碱性环境中减弱（图 7G-H）。然而，这种效果在 ΔecnB-CIPr-BMVs 中未观察到，强调了 EcnB 在此过程中的作用（图 7I）。
图7 CIPr-BMVs酸化SEN
研究结论：
在没有抗生素压力的情况下，CIPr展示出比敏感大肠杆菌（SEN）更强的竞争优势。
细菌膜泡（BMVs）使CIPr具有竞争优势。
膜定位的Entericidin B（EcnB）在CIPr的竞争优势和抗药性形成中发挥关键作用。
酸性代谢物在CIPr -BMVs中起到增强抑制SEN的作用。
这些发现揭示了CIPr在环境中的适应性生长和传播机制，为全面理解抗药性机制、抗药菌的传播和竞争提供了新的视角。
总结
本研究旨在了解CIPr 和SEN之间的竞争动态及其机制，特别是BMVs在抗药性形成和细菌竞争中的作用。通过电子显微镜、蛋白质组学和代谢组学分析BMVs，揭示了CIPr具有竞争优势的潜在机制，特别关注膜定位的Entericidin B（EcnB）在抗药性形成和细菌竞争中的作用。这项研究取得了对CIPr在环境背景下的适应性生长和传播的理解的突破性进展。
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本期为大家介绍一篇来自《Journal of Hazardous Materials》（IF=13.6）的文章，“Unveiling a novel mechanism for competitive advantage of ciprofloxacin-resistant bacteria in the environment through bacterial membrane vesicles”，涉及细菌外膜囊泡，为揭示细菌的耐药性以及在环境中的适应性生长和传播提供了全新的思路。
本文的主要内容是揭示了环境中耐环丙沙星细菌竞争优势的一个新机制，即通过细菌膜囊泡（BMVs）进行传递。研究发现，耐环丙沙星细菌产生的BMVs比敏感菌株产生的BMVs具有更丰富的蛋白质组成，并且这些差异表达的蛋白质主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和RNA降解等途径。进一步研究发现，耐环丙沙星细菌的BMVs能够与敏感菌株发生直接互作用，导致敏感菌株的破坏和内容物泄漏。
此外，研究还发现耐环丙沙星细菌的BMVs通过酸化敏感菌株的细胞内环境和调节细胞膜电位来增强对敏感菌株的抑制作用。研究结果揭示了耐药菌株通过BMVs传递的竞争优势机制，以及BMVs中的EcnB和酸性代谢产物在这一过程中的重要作用。
本文通过连续在低浓度头孢曲松（CIP）中培养，研究了CIP抗性大肠杆菌（CIP r）与敏感大肠杆菌（SEN）的竞争优势，使用共聚焦荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）等技术分析了CIP r产生的细菌膜泡（BMVs）对SEN的影响，然后通过蛋白质组学分析发现了与CIP抗性相关的关键蛋白质，如EcnB、AnsB、AldA、HslV、PurE和CopA，再研究了EcnB在CIP r中的作用以及其在CIP r -BMVs中的表达和代谢组学分析找到了CIP r -BMVs中具有抑制SEN作用的酸性代谢物。
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CIPr（环丙沙星耐药菌）大肠杆菌比敏感性大肠杆菌（SEN:环丙沙星敏感菌）在竞争中更具有优势
为了模拟ARB在环境中低浓度抗生素条件下的形成，将SEN在亚MIC CIP存在的情况下连续传代，导致MIC增加了163倍，并产生了CIPr。生长曲线分析表明，与SEN相比，CIPr在稳定期的生长速度更慢，最终密度更低，这表明对长期CIP暴露产生了适应性（图 1A）。SEN的亚抑制浓度未达到最低限度杀菌浓度 （MBC），使 SEN 和耐药菌株共存一段时间。我们的竞争试验表明，CIPr菌株与SEN相比具有竞争优势（图1A）。
图 1 CIPr与SEN相比具有竞争优势。
BMV 赋予耐药细菌以竞争优势
在探索竞争机制时，作者发现来自 CIPr 培养的上清液（CIPr-SQ）能溶解 SEN 并抑制其生长，而来自 SEN 培养的上清液（SEN-SQ）则没有这种作用（图 1B）。作者重点研究了它们对 CIPr 抑制效果的影响。与 SEN 相比，CIPr 有更高浓度但更小直径的 BMVs（图 1C-F），这可能是适应长期抗生素压力的结果。随后的透射电镜（TEM）分析确认了大多数 BMVs 的直径大约在 15 到 150 纳米之间（图 1）。
向 SEN 培养物中添加 CIPr-BMVs 导致溶解和生长抑制，呈剂量依赖性（图 1G），而将 CIPr-BMVs 添加到 CIPr 或 SEN-BMVs 添加到任一菌株中均未显示出此类效果（图 1C-E）。此外，从多粘菌素抗性细菌中提取的 BMVs 也观察到了对 SEN 的类似抑制效果（图1F）。
这些发现表明 CIPr-BMVs 对 SEN 施加了细菌溶解作用，为 CIPr 提供了竞争优势。与其他已知传递抗性基因的 BMVs 不同，CIPr-BMVs 并未增加 SEN 的最小抑菌浓度（MIC），反而降低了其在 CIP 压力下的生存能力（图 1H）。以上结果表明，CIPr 的竞争优势不是由于 SEN 抗性增加，而是由于直接的细菌溶解作用。共聚焦荧光显微镜显示，DID标记的CIPr-BMVs或SEN-BMVs可以与DAPI标记的SEN融合（图2A），TEM分析进一步支持了CIPr的细菌溶解作用-BMVs 上
SEN，如膜破坏和内容物泄漏所观察到的（图 2B-C）。
图2 CIPr的-BMV 对 SEN 具有细菌溶解作用
BMV中的膜蛋白主要有助于竞争CIP的优势
为了进一步探索 CIPr-BMVs 成分对竞争的潜在影响，作者通过热处理 CIPr-BMVs 以失活其大部分成分。值得注意的是，100°C的热处理导致颗粒大小增加，浓度减少，并且失去了对 SEN 的致死效果（图 3A, D, H, I）。这表明负责竞争优势的关键分子对热失活敏感。此外，对 CIPr-BMVs 进行超声处理也导致了同样的结果（图 3B, E, H, I），表明 BMVs 的结构完整性在其功能中起着关键作用。
在随后的蛋白酶 K 消化实验中，作者观察到 CIPr-BMVs 对 SEN 的致死效果消失，这一效果通过添加蛋白酶 K 抑制剂部分恢复。而蛋白酶 K 和蛋白酶抑制剂本身不影响 BMVs 的颗粒大小和浓度（图 3C, F-I）。由于蛋白酶 K 能够降解表面蛋白而不破坏 BMVs 的膜结构，作者假设 CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制可能归因于 CIPr-BMVs 膜表面蛋白的存在。
图3 不同处理下的CIPr-BMVs对SEN的抑制作用
蛋白质组学分析可识别 CIP 耐药性的关键蛋白
基于数据独立获取（DIA）的定量蛋白质组学方法被用于阐明 SEN-BMVs 和 CIPr-BMVs 的蛋白质组成。这一分析显示 CIPr-BMVs 相较于 SEN-BMVs 有更多样的蛋白质谱，CIPr-BMVs 中鉴定到 1420 种蛋白质，而 SEN-BMVs 中为 624 种。
功率律全局误差模型（PLGEM）分析确认了作者蛋白质组数据的可靠性，皮尔森相关系数为 0.82，调整后的 r2 值为 0.977（图 2A-D）。比较两种 BMVs 类型共有的 561 种蛋白质，鉴定出 354 种差异表达蛋白质（DEPs），其中 159 种在 CIPr-BMVs 中上调，195 种下调（图 4A）。这些 DEPs 主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和 RNA 降解途径，根据 KEGG 分析（图 4B）。值得注意的是，33 种外膜蛋白差异表达，与在 CIPr 中观察到的 BMVs 增加产量一致（图 4C）。标记蛋白 FepA、LpoA、OmpA 和 BamA 的高丰度表明作者获得的 BMVs 高纯度。
为了深入探索 BMVs 蛋白与 CIP 抗性之间的关系，作者选择了 L-天冬酰胺酶（AnsB，上调 18.62 倍）和鸟氨酸氨甲酰转移酶亚基 F（ArgF，下调 117 倍）作为分别代表前十大上调和下调蛋白进行敲除验证（图 4D）。此外，利用 Cytohubba-DMNC（最大邻域组分密度），作者识别出乳醛脱氢酶（AldA，上调 8.25 倍）作为在排除与核糖体相关蛋白后差异蛋白 String 网络中排名最高的蛋白（图 4E）。最小抑制浓度（MIC）测试显示，上调蛋白 AldA 和 AnsB 的删除增加了 SEN 对 CIP 的敏感性（图 2E-F, 图 4F），而下调蛋白 ArgF 的删除则不影响对 CIP 的抗性（图 4F）。
图4 SEN-BMVs和CIPr-BMVs的蛋白质组学分析
在 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 中也注意到了独特的蛋白，CIPr-BMVs 展示了 859 种独特蛋白而 SEN-BMVs 有 63 种（图 5A），可能影响细菌竞争或对 CIP 抗性作出贡献。基因本体（GO）分析突出了 RNA 修改，特别是 RNA 甲基化的显著富集，包括 ncRNA 甲基化、rRNA 甲基化和 tRNA 甲基化（图 5B-C）。此外，针对编码 CIPr-BMVs 或 SEN-BMVs 独特蛋白的基因，包括 EcnB、HslV、PurE、CopA 和 YdhV，构建了敲除菌株。随后的 MIC 测量指出，与 SEN 相比，ΔhslV 和 ΔpurE 菌株显示对 CIP 的抗性降低，而 ΔcopA 表现出增加的抗性。在删除 ΔecnB 和 ΔydhV 基因的菌株中未观察到显著变化（图 5D）。
图5 通过分析 CIPr-BMV 或 SEN-BMV 中的独特蛋白质来鉴定 CIP 耐药相关蛋白和通路
EcnB 是 CIPr 中的关键竞争分子
在作者对 CIPr-BMVs 中独特蛋白的分析中，EcnB 成为这些蛋白中最丰富的蛋白，引起了作者的注意（图 6A）。EcnB 是一种已知具有细菌溶解性质的膜定位蛋白。西方印迹分析确认 EcnB 存在于 CIPr 上清液中，但不在 SEN 中，并且显示 CIPr-BMVs 中的 EcnB 水平高于 SEN-BMVs（图 6B）。然而，在 SEN 和 CIPr 的 100 kDa 超滤管（LC）的流出液中未发现 EcnB。RT-qPCR 进一步揭示了在 CIPr 中 ecnB 在转录水平上的上调，以及其负调控因子 ompR 和 envZ 的同时下调（图 6C）。
作者通过生成敲除株 ΔecnB-CIPr 进一步研究了 EcnB 在 CIP-BMVs 中的作用。生长曲线显示，ecnB 的敲减并不影响细菌生长（图 1A）。有趣的是，ecnB 的删除并未改变菌株对 CIP 的最小抑制浓度（MIC）（图 6D），表明 EcnB 对维持细菌 CIP 抗性不是必需的。然而，在 CIP 的亚抑制浓度下连续 14 代传代后，ΔecnB-SEN 相比于 SEN 的抗性发展速率显著较慢，MIC 倍数变化分别为 27.5 和 106.7（图 6E）。
从 CIPr-BMVs 和 ΔecnB-CIPr-BMVs 的 Nanosight 分析中发现，ecnB 敲除并未影响囊泡大小，但显著降低了囊泡浓度（图 6F-I）。ΔecnB-CIPr-BMVs 对 SEN 生存的影响与 CIPr-BMVs 相比被消除（图 6J）。在共培养竞争实验中，ΔecnB-CIPr 株失去了其对 SEN 的竞争优势（图 6K）。这一发现在使用 SV-HUC-1 的模拟宿主环境中得到了进一步验证。在宿主环境中，通过在 CIPr 中敲除 ecnB，消除了 CIPr 相对于 SEN 的竞争优势（图 6L）。
图6 EcnB是一个关键的竞争因素
CIPr-BMVs中的酸性代谢物增强对敏感菌株的抑制作用
代谢组学分析被用于识别 CIPr-BMVs 中能增强 EcnB 对 SEN 溶解活性的成分。这项分析，通过显著的组间差异和高模型鲁棒性，识别出 CIPr-BMVs 和 SEN-BMVs 之间独特的代谢物谱（图 3A-B）。通过 P 值 < 0.05 和在投影中的变量重要性（VIP）> 1 定义的差异代谢物揭示了顺式十一碳二烯酸作为一个主要成分，可能影响 CIPr-BMVs 内的 pH 环境或它们与其他菌株的相互作用（图 3C-D）。和弦图显示差异代谢物主要来源于脂类和类脂分子（图 3E）。分析主要在 CIPr-BMVs 中发现上调的酸性代谢物（图 7A, 表 S3），表明通过酸化 SEN 增强了 EcnB 的抗菌活性。途径分析指示甘油磷脂、甘油和不饱和脂肪酸代谢的上调（图 7B）。蛋白质组数据与这些发现一致，显示与脂肪酸合成和代谢相关的蛋白增加（图 7C-D），与之前关于 CIP 抗性中脂肪酸代谢的研究一致。
作者进一步研究了 CIPr-BMVs 对 SEN 的 pH 和膜电位的影响。结果显示，SEN 的 pH 值下降，且在暴露于 CIPr-BMVs 时膜电位显著去极化（图 7E-F）。此外，CIPr-BMVs 对 SEN 的抑制效果在更酸性条件下增强，在更碱性环境中减弱（图 7G-H）。然而，这种效果在 ΔecnB-CIPr-BMVs 中未观察到，强调了 EcnB 在此过程中的作用（图 7I）。
图7 CIPr-BMVs酸化SEN
研究结论：
在没有抗生素压力的情况下，CIPr展示出比敏感大肠杆菌（SEN）更强的竞争优势。
细菌膜泡（BMVs）使CIPr具有竞争优势。
膜定位的Entericidin B（EcnB）在CIPr的竞争优势和抗药性形成中发挥关键作用。
酸性代谢物在CIPr -BMVs中起到增强抑制SEN的作用。
这些发现揭示了CIPr在环境中的适应性生长和传播机制，为全面理解抗药性机制、抗药菌的传播和竞争提供了新的视角。
总结
本研究旨在了解CIPr 和SEN之间的竞争动态及其机制，特别是BMVs在抗药性形成和细菌竞争中的作用。通过电子显微镜、蛋白质组学和代谢组学分析BMVs，揭示了CIPr具有竞争优势的潜在机制，特别关注膜定位的Entericidin B（EcnB）在抗药性形成和细菌竞争中的作用。这项研究取得了对CIPr在环境背景下的适应性生长和传播的理解的突破性进展。
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