股骨颈骨折 fracture of femoral neck
股骨颈骨折是指股骨头下到股骨颈基底的骨折，多属于囊内骨折，好发于中、老年人。大多数患者存在骨质疏松，摔倒、扭伤等轻微暴力即可导致股骨颈骨折，容易发生骨折不愈合和股骨头坏死。股骨颈骨折患者通常伴有心血管疾病、肺部疾病、糖尿病、骨质疏松和营养不良等情况，需引起重视。青壮年患者出现股骨颈骨折所需暴力大，主要由高能量创伤引起，血供损伤程度重，股骨头缺血坏死的发生率也高。
临床病例
患者女，5 8 岁，“跌倒后右髋疼痛伴活动受限8 小时”入院。查体：血压180/105mmHg，右髋关节无红肿，右下肢较健侧短5mm，轻度外旋，右髋部前方压痛（+），右下肢轴向叩击痛（+），双下肢感觉正常。
【问题1】 通过病史及查体患者目前的初步诊断及处理。
思路1：患者为老年绝经后女性，跌倒后致髋部疼痛，肢体短缩外旋畸形，关节活动受限，需首先考虑诊断常见的髋部骨折：股骨颈及股骨转子间骨折。同时全面的查体排除是否存在合并其他部位损伤，通过行骨盆正位及右髋正侧位X 线检查明确诊断。对患者行右下肢皮肤牵引及丁字鞋制动，缓解疼痛。
知识点
股骨颈骨折的诊治要点
1.好发于中老年人，常合并有骨质疏松等内科疾病，轻微暴力即导致骨折。
2.无移位骨折患肢没有明显畸形，移位骨折存在患肢短缩、外旋畸形。
3.保守治疗长期卧床，易发生肺部感染、压疮、深静脉血栓等并发症。
4.骨折不愈合和股骨头缺血坏死率高。
思路2：通过影像学检查明确股骨颈骨折的临床分型，制订相应的诊疗计划，通常进行X 线片检查即可明确诊断。患者右股骨颈骨折明确，需进一步根据骨折解剖部位、骨折线方向及骨折移位程度进临床分型分型（图3-8-56）。
图3-8-56 股骨颈骨折术前X线片
知识点
股骨颈骨折常用的临床分型
1.按骨折部位分型
（1）头下骨折：骨折线位于股骨头与股骨颈的交界处。骨折后股骨头游离，同时股骨头血供大部分中断，因此骨折愈合困难，容易发生股骨头坏死。
（2）经颈型骨折：这类骨折由于剪力大、骨折不稳，远折端通常向上移位，骨折移位和移位造成的关节囊、滑膜扭曲、牵拉，会引起股骨头的血供受损，从而产生骨折不易愈合和股骨头坏死。
（3）基底部骨折：骨折线位于股骨颈与大转子之间，由于骨折两端的血液循环良好，骨折容易愈合，不易发生股骨头坏死。
2.骨折线角度分型 按照骨折线与水平线的夹角（Pauwels 角）将股骨颈骨折分为3型：Ⅰ型骨折线与水平线夹角≤30°；Ⅱ型夹角30°～50°；Ⅲ型夹角＞50°。夹角越大，即骨折线越垂直，骨折端受到剪切应力增大，骨折越不稳定，不愈合率随之增加。由于该分型要求股骨颈与X 线片平行，多数患者由于疼痛不能很好的合作，导致结果不准确，目前较少使用。
3.Garden 分型 Garden 根据骨折移位程度，将股骨颈骨折分为4 型（图3-8-57）。
图3-8-57 股骨颈骨折Garden分型
Ⅰ型：不全骨折，股骨颈下方骨小梁完整，该型包括所谓“外展嵌插骨折”。
Ⅱ型：完全骨折，但无移位。
Ⅲ型：完全骨折，部分移位，该型骨折X 线片上可以看到骨折远端上移、外旋，股骨头常后倾，骨折端尚有部分接触。
Ⅳ型：完全骨折，完全移位，该型骨折X 线片上表现为骨折断端完全无接触，而股骨头与髋臼相对关系正常。
Garden 分型从Ⅰ型至Ⅳ型，股骨颈骨折严重程度递增，不愈合率与股骨头缺血坏死率也随之增加，因此在国际上广泛应用。
根据患者的X 线片，其股骨颈骨折属于经颈型股骨颈骨折，PauwelsⅡ型、Garden 分型Ⅲ型。【问题2】 该患者的临床治疗方案及预后。
思路1：不同年龄、不同类型的股骨颈骨折有着不同的治疗方案，在临床工作中，一般通过对患者全身情况、年龄、骨折临床分型等多个方面的评估，选择最适合的治疗方式。
知识点
股骨颈骨折的外科治疗原则
GardenⅠ型、Ⅱ型无移位或外展嵌插骨折，可采用非手术治疗，将患肢置于轻度外展位，皮肤牵引或丁字鞋固定，3 个月下地逐步负重。这些患者年龄比较大，长期卧床容易发生肺部感染、压疮、深静脉血栓等并发症，而且临床上常出现部分稳定骨折转变成移位骨折，因此，除绝对手术禁忌证外，多主张内固定术治疗，利于患者康复。
知识点
手术治疗的选择
1.内固定术
（1）适应证：没有髋关节伴发疾病、能获得良好复位与固定，且能够耐受手术的所用股骨颈骨折。具体包括：①GardenⅠ型、Ⅱ型骨折，年龄不超过65 岁的GardenⅢ、Ⅳ型，髋关节不存在骨关节炎、股骨头坏死等病变；②移位型骨折、年龄大且全身情况差，合并重要脏器功能障碍不能耐受关节置换手术者。
（2）不同内固定的选择原则
1）空心加压螺钉内固定：3 枚平行螺纹钉是股骨颈骨折的标准做法。闭合复位成功后，通常采用3 枚平行空心螺钉内固定，螺纹要过骨折线，3 枚螺钉呈三角形植入，多数主张倒三角形具有良好的生物力学性能，下方螺钉和后方螺钉应该距离股骨颈皮质3mm 以内固定最为牢固。
2）多针内固定：该方法有多个固定轴心，能有效地控制股骨头的旋转剪应力，并有加压固定作用。具有针细破坏血供少、操作简单的优点。
3）滑动式钉板系统：为髓外内固定装置，其内固定作用与空心螺钉相似，但有外侧固定于皮质的接骨板，比空心钉坚固，更适合于骨折线比较垂直的内收型骨折、股骨颈后方皮质受损严重的骨折，通常在髋螺钉上方平行增加1 枚加压螺纹钉，防止旋转。
2.人工股骨头置换术
适应证：70～75 岁以上GardenⅢ型、Ⅳ型，尤其是有多种合并疾病，行全髋关节置换手术风险较高。如果髋关节外伤前存在原有疾病影响关节功能者，理论上应该行全髋置换手术，需要综合评估手术风险。
3.人工全髋关节置换术
适应证：年龄在65～75 岁之间的GardenⅢ型、Ⅳ型，健康状况能够耐受手术，对于术前髋关节存在影响关节功能的病变，如股骨头坏死、先天性髋关节脱位等，可以不考虑年龄的限制。
4.带血运的骨瓣植骨内固定术 适用于青壮年股骨颈陈旧性股骨颈骨折，能提高骨折愈合率和降低股骨头缺血坏死率。常用的有缝匠肌蒂髂骨瓣植骨术和旋髂深动脉髂骨瓣植骨术。
该患者年龄未超过65 岁，全身状况尚可，骨折的临床分型为GardenⅢ型，所以手术医师选择了骨折闭合复位空心加压螺钉内固定治疗骨折，术后复位良好（图3-8-58）。
图3-8-58 股骨颈骨折术后X线片
思路2：股骨颈的血供特点决定了股骨颈骨折特别是有移位的骨折，术后可能出现骨不连及股骨头缺血坏死等并发症，需在术前向患者及家属充分交代清楚。
知识点
股骨头的血供特点
1.支持带血管 股动脉或股深动脉发出旋股内、旋股外侧动脉，在股骨颈基底部形成动脉环，发出4 条颈升动脉，其中由旋股内血管发出的骺外侧动脉供应股骨头大部分血供，是最主要的血管分支，供应股骨头外上方为主。在股骨颈骨折移位时该动脉易发生损伤。
2.股骨干滋养动脉 只供应到股骨颈，与股骨头血管相互吻合较少。
3.股骨头圆韧带动脉 来源于闭孔动脉，一般供给股骨头凹窝部分周围少部分血供，老年人此动脉多已闭塞。
知识点
股骨颈骨折最常见的并发症是股骨头缺血坏死和骨折不愈合
1.股骨头缺血坏死 发生率从8%～40%不等，股骨头缺血坏死与患者年龄、股骨头的血供、骨折移位程度、手术时间以及复位的效果等因素有关，其中股骨头的血供状态是关键因素。根据Garden 分型，结合SPECT/CT、动态MRI、激光超声多普勒等手段检测股骨颈骨折后股骨头的血供状态，从而评估股骨头缺血坏死的风险，有利于手术决策和早期干预。
2.骨折不愈合 随着内固定技术的进步，股骨颈骨折后骨不连已经比较少了，骨不连的发生与血供、骨折复位质量、骨质疏松的程度、骨折断端的粉碎程度有关。需要重视骨折复位质量、恰当的内固定方法，如果不能获得可靠的复位固定，应该选择人工关节置换。
【诊疗流程】
股骨颈骨折是指股骨头下到股骨颈基底的骨折，多属于囊内骨折，好发于中、老年人。大多数患者存在骨质疏松，摔倒、扭伤等轻微暴力即可导致股骨颈骨折，容易发生骨折不愈合和股骨头坏死。股骨颈骨折患者通常伴有心血管疾病、肺部疾病、糖尿病、骨质疏松和营养不良等情况，需引起重视。青壮年患者出现股骨颈骨折所需暴力大，主要由高能量创伤引起，血供损伤程度重，股骨头缺血坏死的发生率也高。
临床病例
患者女，5 8 岁，“跌倒后右髋疼痛伴活动受限8 小时”入院。查体：血压180/105mmHg，右髋关节无红肿，右下肢较健侧短5mm，轻度外旋，右髋部前方压痛（+），右下肢轴向叩击痛（+），双下肢感觉正常。
【问题1】 通过病史及查体患者目前的初步诊断及处理。
思路1：患者为老年绝经后女性，跌倒后致髋部疼痛，肢体短缩外旋畸形，关节活动受限，需首先考虑诊断常见的髋部骨折：股骨颈及股骨转子间骨折。同时全面的查体排除是否存在合并其他部位损伤，通过行骨盆正位及右髋正侧位X 线检查明确诊断。对患者行右下肢皮肤牵引及丁字鞋制动，缓解疼痛。
知识点
股骨颈骨折的诊治要点
1.好发于中老年人，常合并有骨质疏松等内科疾病，轻微暴力即导致骨折。
2.无移位骨折患肢没有明显畸形，移位骨折存在患肢短缩、外旋畸形。
3.保守治疗长期卧床，易发生肺部感染、压疮、深静脉血栓等并发症。
4.骨折不愈合和股骨头缺血坏死率高。
思路2：通过影像学检查明确股骨颈骨折的临床分型，制订相应的诊疗计划，通常进行X 线片检查即可明确诊断。患者右股骨颈骨折明确，需进一步根据骨折解剖部位、骨折线方向及骨折移位程度进临床分型分型（图3-8-56）。
图3-8-56 股骨颈骨折术前X线片
知识点
股骨颈骨折常用的临床分型
1.按骨折部位分型
（1）头下骨折：骨折线位于股骨头与股骨颈的交界处。骨折后股骨头游离，同时股骨头血供大部分中断，因此骨折愈合困难，容易发生股骨头坏死。
（2）经颈型骨折：这类骨折由于剪力大、骨折不稳，远折端通常向上移位，骨折移位和移位造成的关节囊、滑膜扭曲、牵拉，会引起股骨头的血供受损，从而产生骨折不易愈合和股骨头坏死。
（3）基底部骨折：骨折线位于股骨颈与大转子之间，由于骨折两端的血液循环良好，骨折容易愈合，不易发生股骨头坏死。
2.骨折线角度分型 按照骨折线与水平线的夹角（Pauwels 角）将股骨颈骨折分为3型：Ⅰ型骨折线与水平线夹角≤30°；Ⅱ型夹角30°～50°；Ⅲ型夹角＞50°。夹角越大，即骨折线越垂直，骨折端受到剪切应力增大，骨折越不稳定，不愈合率随之增加。由于该分型要求股骨颈与X 线片平行，多数患者由于疼痛不能很好的合作，导致结果不准确，目前较少使用。
3.Garden 分型 Garden 根据骨折移位程度，将股骨颈骨折分为4 型（图3-8-57）。
图3-8-57 股骨颈骨折Garden分型
Ⅰ型：不全骨折，股骨颈下方骨小梁完整，该型包括所谓“外展嵌插骨折”。
Ⅱ型：完全骨折，但无移位。
Ⅲ型：完全骨折，部分移位，该型骨折X 线片上可以看到骨折远端上移、外旋，股骨头常后倾，骨折端尚有部分接触。
Ⅳ型：完全骨折，完全移位，该型骨折X 线片上表现为骨折断端完全无接触，而股骨头与髋臼相对关系正常。
Garden 分型从Ⅰ型至Ⅳ型，股骨颈骨折严重程度递增，不愈合率与股骨头缺血坏死率也随之增加，因此在国际上广泛应用。
根据患者的X 线片，其股骨颈骨折属于经颈型股骨颈骨折，PauwelsⅡ型、Garden 分型Ⅲ型。【问题2】 该患者的临床治疗方案及预后。
思路1：不同年龄、不同类型的股骨颈骨折有着不同的治疗方案，在临床工作中，一般通过对患者全身情况、年龄、骨折临床分型等多个方面的评估，选择最适合的治疗方式。
知识点
股骨颈骨折的外科治疗原则
GardenⅠ型、Ⅱ型无移位或外展嵌插骨折，可采用非手术治疗，将患肢置于轻度外展位，皮肤牵引或丁字鞋固定，3 个月下地逐步负重。这些患者年龄比较大，长期卧床容易发生肺部感染、压疮、深静脉血栓等并发症，而且临床上常出现部分稳定骨折转变成移位骨折，因此，除绝对手术禁忌证外，多主张内固定术治疗，利于患者康复。
知识点
手术治疗的选择
1.内固定术
（1）适应证：没有髋关节伴发疾病、能获得良好复位与固定，且能够耐受手术的所用股骨颈骨折。具体包括：①GardenⅠ型、Ⅱ型骨折，年龄不超过65 岁的GardenⅢ、Ⅳ型，髋关节不存在骨关节炎、股骨头坏死等病变；②移位型骨折、年龄大且全身情况差，合并重要脏器功能障碍不能耐受关节置换手术者。
（2）不同内固定的选择原则
1）空心加压螺钉内固定：3 枚平行螺纹钉是股骨颈骨折的标准做法。闭合复位成功后，通常采用3 枚平行空心螺钉内固定，螺纹要过骨折线，3 枚螺钉呈三角形植入，多数主张倒三角形具有良好的生物力学性能，下方螺钉和后方螺钉应该距离股骨颈皮质3mm 以内固定最为牢固。
2）多针内固定：该方法有多个固定轴心，能有效地控制股骨头的旋转剪应力，并有加压固定作用。具有针细破坏血供少、操作简单的优点。
3）滑动式钉板系统：为髓外内固定装置，其内固定作用与空心螺钉相似，但有外侧固定于皮质的接骨板，比空心钉坚固，更适合于骨折线比较垂直的内收型骨折、股骨颈后方皮质受损严重的骨折，通常在髋螺钉上方平行增加1 枚加压螺纹钉，防止旋转。
2.人工股骨头置换术
适应证：70～75 岁以上GardenⅢ型、Ⅳ型，尤其是有多种合并疾病，行全髋关节置换手术风险较高。如果髋关节外伤前存在原有疾病影响关节功能者，理论上应该行全髋置换手术，需要综合评估手术风险。
3.人工全髋关节置换术
适应证：年龄在65～75 岁之间的GardenⅢ型、Ⅳ型，健康状况能够耐受手术，对于术前髋关节存在影响关节功能的病变，如股骨头坏死、先天性髋关节脱位等，可以不考虑年龄的限制。
4.带血运的骨瓣植骨内固定术 适用于青壮年股骨颈陈旧性股骨颈骨折，能提高骨折愈合率和降低股骨头缺血坏死率。常用的有缝匠肌蒂髂骨瓣植骨术和旋髂深动脉髂骨瓣植骨术。
该患者年龄未超过65 岁，全身状况尚可，骨折的临床分型为GardenⅢ型，所以手术医师选择了骨折闭合复位空心加压螺钉内固定治疗骨折，术后复位良好（图3-8-58）。
图3-8-58 股骨颈骨折术后X线片
思路2：股骨颈的血供特点决定了股骨颈骨折特别是有移位的骨折，术后可能出现骨不连及股骨头缺血坏死等并发症，需在术前向患者及家属充分交代清楚。
知识点
股骨头的血供特点
1.支持带血管 股动脉或股深动脉发出旋股内、旋股外侧动脉，在股骨颈基底部形成动脉环，发出4 条颈升动脉，其中由旋股内血管发出的骺外侧动脉供应股骨头大部分血供，是最主要的血管分支，供应股骨头外上方为主。在股骨颈骨折移位时该动脉易发生损伤。
2.股骨干滋养动脉 只供应到股骨颈，与股骨头血管相互吻合较少。
3.股骨头圆韧带动脉 来源于闭孔动脉，一般供给股骨头凹窝部分周围少部分血供，老年人此动脉多已闭塞。
知识点
股骨颈骨折最常见的并发症是股骨头缺血坏死和骨折不愈合
1.股骨头缺血坏死 发生率从8%～40%不等，股骨头缺血坏死与患者年龄、股骨头的血供、骨折移位程度、手术时间以及复位的效果等因素有关，其中股骨头的血供状态是关键因素。根据Garden 分型，结合SPECT/CT、动态MRI、激光超声多普勒等手段检测股骨颈骨折后股骨头的血供状态，从而评估股骨头缺血坏死的风险，有利于手术决策和早期干预。
2.骨折不愈合 随着内固定技术的进步，股骨颈骨折后骨不连已经比较少了，骨不连的发生与血供、骨折复位质量、骨质疏松的程度、骨折断端的粉碎程度有关。需要重视骨折复位质量、恰当的内固定方法，如果不能获得可靠的复位固定，应该选择人工关节置换。
【诊疗流程】
现在的网络给大家的确提供了太多的便利，但是换一个角度看问题，过度透明真的给那些心理承受能力弱的人带来了不可言喻的打击。而处于这两种情境中的一员，时常也游离，模糊！感叹为社会发展所奉献时间及生命的人的不易！也感叹这社会荒废且迷茫的人的心酸！（最近真的看到太多人的生命画上句点的信息，都挺让人深思，所以感慨一番，也是希望自己的一生不求奢华，只求安稳！） https://t.cn/R2WxuoH
客户文献分享| IF=14.612，基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反应癌症免疫疗
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
了解金开瑞iTRAQ定量蛋白质组学技术：https://t.cn/A6V4xP7Y
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
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