【珍稀濒危植物龙州金花茶生存现状及保护策略研究取得进展】
龙州金花茶(Camellia longzhouensis J.Y. Luo)是山茶科(Theaceae)的常绿灌木或小乔木(图1)。因其仅分布于广西龙州且花金黄色得名,是世界名贵观赏植物,有“植物界大熊猫”和“茶族皇后”的美誉。龙州金花茶是中国特有种、国家II级保护植物。其花可供观赏,也可制成保健型茶饮,兼具濒危性、经济价值、特有性,具有较高科研价值。2015年,世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN)将龙州金花茶评估为濒危等级,指出龙州金花茶正面临栖息地退化威胁。
中国科学院华南植物园生态与环境科学研究中心硕士生许展慧在研究员任海指导下,与广西植物研究所研究员韦霄和广西弄岗国家级自然保护区合作,系统研究了龙州金花茶的分布、生境特征、种群结构、致濒危因子和综合保护策略。研究发现,龙州金花茶分布范围狭窄,仅分布在广西弄岗国家级自然保护区及边缘,生境为喀斯特天然次生林;野外仅有3个龙州金花茶居群,共58株;龙州金花茶种群结构不合理,表现为幼年个体缺少。影响龙州金花茶生存受威胁的主要生物因素是同一层次、生态位相似的海南大风子(Hydnocarpus hainanensis)和米扬噎(Streblus tonkinensis)的竞争,影响龙州金花茶生存的环境因子有土壤N、P含量和环境光强(图2)。其他因素还包括人为盗采、物种自身繁殖障碍。根据该物种的现状,按IUCN标准,应将其调整为极度濒危等级。
基于此,科研人员提出了龙州金花茶的综合保护策略:扩大弄岗国家级自然保护区的范围,将保护区边缘的野生个体纳入保护;标记所有野外个体,定期巡查,清理竞争植物,实现有效的就地保护;将所有野外个体取枝条进行嫁接或扦插,建立全遗传多样性资源圃以近地保护遗传多样性;在气候相似的植物园建立更多迁地保护种群;在3个原生居群中分别引种其他居群的个体建立增强回归群体以增加遗传多样性;在弄岗国家级自然保护区以外建立能自我更新的异地回归种群,以应对气候变化对该物种存活的可能影响;进一步优化繁殖技术,栽培时营造近似原生境的土壤条件和光强环境;促进龙州金花茶商品化生产,以减少野生植株的生存压力。龙州金花茶的综合保护策略对喀斯特贫困地区其他珍稀濒危植物保护和可持续利用具有参考价值。
相关研究成果发表在Global Ecology and Conservation上。
论文链接:
https://t.cn/A6f45hJP
(来源:华南植物园)
龙州金花茶(Camellia longzhouensis J.Y. Luo)是山茶科(Theaceae)的常绿灌木或小乔木(图1)。因其仅分布于广西龙州且花金黄色得名,是世界名贵观赏植物,有“植物界大熊猫”和“茶族皇后”的美誉。龙州金花茶是中国特有种、国家II级保护植物。其花可供观赏,也可制成保健型茶饮,兼具濒危性、经济价值、特有性,具有较高科研价值。2015年,世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN)将龙州金花茶评估为濒危等级,指出龙州金花茶正面临栖息地退化威胁。
中国科学院华南植物园生态与环境科学研究中心硕士生许展慧在研究员任海指导下,与广西植物研究所研究员韦霄和广西弄岗国家级自然保护区合作,系统研究了龙州金花茶的分布、生境特征、种群结构、致濒危因子和综合保护策略。研究发现,龙州金花茶分布范围狭窄,仅分布在广西弄岗国家级自然保护区及边缘,生境为喀斯特天然次生林;野外仅有3个龙州金花茶居群,共58株;龙州金花茶种群结构不合理,表现为幼年个体缺少。影响龙州金花茶生存受威胁的主要生物因素是同一层次、生态位相似的海南大风子(Hydnocarpus hainanensis)和米扬噎(Streblus tonkinensis)的竞争,影响龙州金花茶生存的环境因子有土壤N、P含量和环境光强(图2)。其他因素还包括人为盗采、物种自身繁殖障碍。根据该物种的现状,按IUCN标准,应将其调整为极度濒危等级。
基于此,科研人员提出了龙州金花茶的综合保护策略:扩大弄岗国家级自然保护区的范围,将保护区边缘的野生个体纳入保护;标记所有野外个体,定期巡查,清理竞争植物,实现有效的就地保护;将所有野外个体取枝条进行嫁接或扦插,建立全遗传多样性资源圃以近地保护遗传多样性;在气候相似的植物园建立更多迁地保护种群;在3个原生居群中分别引种其他居群的个体建立增强回归群体以增加遗传多样性;在弄岗国家级自然保护区以外建立能自我更新的异地回归种群,以应对气候变化对该物种存活的可能影响;进一步优化繁殖技术,栽培时营造近似原生境的土壤条件和光强环境;促进龙州金花茶商品化生产,以减少野生植株的生存压力。龙州金花茶的综合保护策略对喀斯特贫困地区其他珍稀濒危植物保护和可持续利用具有参考价值。
相关研究成果发表在Global Ecology and Conservation上。
论文链接:
https://t.cn/A6f45hJP
(来源:华南植物园)
【#手持黄码如何去医院做核酸检测#?速看各医院指引[来]】
这两天,不少市民反映,粤康码或是穗康码的绿码突然转为黄码,持黄码人员还能看病吗?去哪家医院可以进行核酸检测?
记者梳理发现,目前大多数医院发现持“黄码”就诊人员,将第一时间引导其去发热门诊进行排查,需停留约4-8小时待核酸检测阴性后方可离开。或者可选择返回社区临时核酸检测点接受核酸检测。个别医院不接受“黄码”人员核酸检测,请关注各家医院具体指引。
广东药科大学附属第一医院
1、当您的健康码为“黄码”时,如仅有核酸检测需求,请自行前往街道设置的临时采样点进行检测;
2、“黄码”且伴有发热、咳嗽、腹泻、咽痛等症状的就诊人员,将由专人陪同至发热门诊就诊。
广州市妇女儿童医疗中心
1.儿童:由预检分诊处专人陪同至发热门诊,接受核酸检测,并在隔离区域等待核酸检测结果,阴性后方可接受其他诊疗及离院。原则上陪同家属必须持绿色“通行穗康码”才能进入医院。
2.成人:不接诊成人内科疾病引起的发热,建议到附近综合性医院发热门诊就诊。妇产科成人就诊者由预检分诊处专人陪同至发热门诊(或发热诊室),接受核酸检测,并在隔离区域等待新冠核酸检测结果,阴性后方可接受其他诊疗及离院。
广州市红十字会医院
1、健康码为红码人员、3天内有发热(体温≥37.3℃)、国内中高风险地区旅居史的人员,普通门诊不予接诊,请先到发热门诊就诊。
2、原则上不接诊21天内有国外、台湾、香港等地区旅居史的人员,请到政府指定医疗机构就诊。
3、健康码为黄码人员返回社区临时核酸检测点接受核酸检测。
4、健康码为绿码人员需提前预约挂号,我院门诊已实行非急诊全预约制,非急诊患者请务必提前预约。
5、来自广州市荔湾区、海珠区、番禺区和佛山市的普通门诊患者必须提供3天内核酸检测阴性报告,方可就诊。
6、口腔科门诊、耳鼻喉科门诊、眼科门诊和胃肠镜检查、纤支镜检查等患者必须提供3天内核酸检测阴性报告。
南方医科大学珠江医院
所有人员进入医疗区域前,须主动出示穗康码(健康码)、接受体温检测、自觉正确佩戴口罩(禁止佩戴带阀门的口罩)、接受流行病史、发热等相关病史询问。
1、健康码为红码人员:
3天内出现发热(体温≥37.3℃)的人员、或14天内有国外、台湾、香港、国内中高风险地区旅居史的人员,一律由专人引导至发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
2、健康码为黄码人员:
若无发热、腹泻等症状,建议返回社区临时核酸检测点接受核酸检测。如有发热一律由专人引导至发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
3、健康码为绿码人员:
需提前预约挂号就诊。
4、中风险地区患者须持3天内核酸检测阴性报告方可就诊;高风险地区的患者必须提供当日内核酸检测阴性报告方可就诊。疫情风险等级区域以国务院公布信息为准。
中山大学附属口腔医院
1、持“红码”人员、3天内有发热(体温≥37.3℃)人员,14天内有国外境外旅居史或境内中高风险地区旅居史的人员,由医院专车送往发热门诊就诊,口腔门诊不予接诊。
2、持“黄码”人员,请自行到发热门诊或社区核酸检测点接受核酸检测,待核酸结果阴性且通行码为“绿码”后再预约就诊。
3、持“绿码”人员且无流行病学史及新冠肺炎症状的患者,凭公众号预约成功通知或预约短信就诊。
广东省中医院
1. 健康码为红码的人员:一律由专人送去发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
2. 健康码为黄码的人员:选择到发热门诊(需停留约4-8小时待核酸检测阴性后方可离开)或者返回社区临时核酸检测点接受核酸检测。
3. 健康码为绿色的人员:非急诊患者请提前预约挂号。
广东省第二人民医院
1.健康码为红码人员、3天内有发热(体温≥37.3℃)人员或14天内有国外、台湾、香港、国内中高风险地区旅居史的人员,一律由专人送去发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
2.健康码为黄码人员到发热门诊就诊,其间在留观区等待,核酸检测结果(约4小时)出来阴性后,方可离开。
3.对于无智能手机的老年人等特殊群体,保留查验身份证及线下填写流调表,查验后方可就诊。
4.口腔科门诊、耳鼻咽喉头颈外科门诊、眼科门诊、内窥镜检查需提供3天内的核酸检测阴性报告,血液透析患者必须提供7天内核酸检测阴性报告。
广州市第十二人民医院
持“通行穗康码”黄码的就诊人员,就诊流程如下:
由医院2号门进入,专人陪同至发热门诊,接受核酸检测(需自费),并在隔离区域等待核酸检测结果,阴性后方可接受其他诊疗或离院。原则上陪同家属必须持绿色“通行穗康码”才能进入医院。 https://t.cn/A6V0ayhY
#官方回应粤康码为何变黄# #广州疫情# #深圳疫情#
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广东药科大学附属第一医院
1、当您的健康码为“黄码”时,如仅有核酸检测需求,请自行前往街道设置的临时采样点进行检测;
2、“黄码”且伴有发热、咳嗽、腹泻、咽痛等症状的就诊人员,将由专人陪同至发热门诊就诊。
广州市妇女儿童医疗中心
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2.成人:不接诊成人内科疾病引起的发热,建议到附近综合性医院发热门诊就诊。妇产科成人就诊者由预检分诊处专人陪同至发热门诊(或发热诊室),接受核酸检测,并在隔离区域等待新冠核酸检测结果,阴性后方可接受其他诊疗及离院。
广州市红十字会医院
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3、健康码为黄码人员返回社区临时核酸检测点接受核酸检测。
4、健康码为绿码人员需提前预约挂号,我院门诊已实行非急诊全预约制,非急诊患者请务必提前预约。
5、来自广州市荔湾区、海珠区、番禺区和佛山市的普通门诊患者必须提供3天内核酸检测阴性报告,方可就诊。
6、口腔科门诊、耳鼻喉科门诊、眼科门诊和胃肠镜检查、纤支镜检查等患者必须提供3天内核酸检测阴性报告。
南方医科大学珠江医院
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1、健康码为红码人员:
3天内出现发热(体温≥37.3℃)的人员、或14天内有国外、台湾、香港、国内中高风险地区旅居史的人员,一律由专人引导至发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
2、健康码为黄码人员:
若无发热、腹泻等症状,建议返回社区临时核酸检测点接受核酸检测。如有发热一律由专人引导至发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
3、健康码为绿码人员:
需提前预约挂号就诊。
4、中风险地区患者须持3天内核酸检测阴性报告方可就诊;高风险地区的患者必须提供当日内核酸检测阴性报告方可就诊。疫情风险等级区域以国务院公布信息为准。
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1、持“红码”人员、3天内有发热(体温≥37.3℃)人员,14天内有国外境外旅居史或境内中高风险地区旅居史的人员,由医院专车送往发热门诊就诊,口腔门诊不予接诊。
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1.健康码为红码人员、3天内有发热(体温≥37.3℃)人员或14天内有国外、台湾、香港、国内中高风险地区旅居史的人员,一律由专人送去发热门诊就诊,普通门诊不予接诊。
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客户文献分享| IF=14.612,基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反应癌症免疫疗
本期解读
题目:A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊:JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子:14.612/Q1
合作技术:iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原,但免疫疗法仍是保守的,反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95%的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是,单靶标药物的功效是有限的,而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而,即使在高抗原负担的肿瘤中,全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此,研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统,该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合,DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接,形成携带肿瘤蛋白的微纤维,该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬,并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中,该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外,在小鼠黑色素瘤的体内研究中,DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先,研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY(Asp-Phe-Tyr),并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物,利用倒置显微镜和扫描电子显微镜(SEM)观察均表明是由DFY聚合成的微纤维(图1b和图1b)。然后,研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因(TYR)表达的差异,基于CCLE数据库(https://t.cn/Ev9rmGW)分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平,结果表明,与其他癌细胞分型相比,黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量(图1e)。此外,研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应(图1f),结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外,研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽(Asp-Phe-Phe,DFF)注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示,注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长,相比之下,大多数DFF在肿瘤中被快速清除了,因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明,DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57%(图2e),在与各种B16细胞抑制剂孵育后,发现单苯甲酮(酪氨酸酶抑制剂)和谷胱甘肽(GSH)均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来(图2f)。Ac-DEVD-CHO(凋亡抑制剂),ferrostatin-1(促肥大症抑制剂),necrostatin-1(坏死性抑制剂),TBHQ和BHA(醌氧化还原酶诱导剂)却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是,单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察,发现长期培养后,微纤维从细胞中释放出来(图4Sd,e)。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白,并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞,并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此,由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异,研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型,与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a,b和S5所示,在DFY聚合后,确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白(倍数变化1.5和P <0.05,超几何测试)。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明,这些蛋白质大多数与细胞代谢(氨基酸代谢,糖代谢),能量供应(糖酵解,有氧呼吸)和蛋白质合成(核糖体)相关(图3c)。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能(图3d)。差异蛋白主要来自核糖体,线粒体,细胞核和高尔基体。此外,通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用(图3e)。来自细胞器的蛋白质,特别是核糖体,线粒体和细胞核中的蛋白质,形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质,从而导致这些蛋白质的显着减少。另外,作为专业的产生黑色素的细胞器,还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达(图S5)。GO富集分析的结果表明,用DFY处理后,黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析(PCA)分析了Cys含量,理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标(图3f),该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到,DFY处理可抑制线粒体功能,抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成(图S6)。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬,通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC(RAW264.7和DC)对DFY或pDFY的摄取(图4a,b)。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累,但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明,纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应,用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力(图4c)。与裂解物组相比,裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外,与裂解物+ pDFY相比,裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着(P = 0.0002)。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育,以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力(图4d),研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3%的B16细胞。相反,裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30%的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上,考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性,抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后,经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究,证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集,裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后,研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体(aPD1)或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠(图5a)实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91%的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率(图5c)。在所有组中,用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明,肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白,而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示,DFY + aPD1处理后,包括干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在内的免疫激活标记物增加(图5f)。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统,粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示,在相同深度下,用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度(MFI)高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比,DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍(图6h)。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力(图6i)。在为期16天的实验中,DFY @ gel显示出与DFY(腹膜内注射)相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比,评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中,研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统,该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞,该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时,通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核,线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白,这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后,肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来,形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此,设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC,并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性,并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中,发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
了解金开瑞iTRAQ定量蛋白质组学技术:https://t.cn/A6V4xP7Y
本期解读
题目:A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊:JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子:14.612/Q1
合作技术:iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原,但免疫疗法仍是保守的,反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95%的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是,单靶标药物的功效是有限的,而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而,即使在高抗原负担的肿瘤中,全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此,研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统,该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合,DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接,形成携带肿瘤蛋白的微纤维,该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬,并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中,该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外,在小鼠黑色素瘤的体内研究中,DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先,研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY(Asp-Phe-Tyr),并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物,利用倒置显微镜和扫描电子显微镜(SEM)观察均表明是由DFY聚合成的微纤维(图1b和图1b)。然后,研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因(TYR)表达的差异,基于CCLE数据库(https://t.cn/Ev9rmGW)分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平,结果表明,与其他癌细胞分型相比,黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量(图1e)。此外,研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应(图1f),结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外,研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽(Asp-Phe-Phe,DFF)注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示,注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长,相比之下,大多数DFF在肿瘤中被快速清除了,因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明,DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57%(图2e),在与各种B16细胞抑制剂孵育后,发现单苯甲酮(酪氨酸酶抑制剂)和谷胱甘肽(GSH)均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来(图2f)。Ac-DEVD-CHO(凋亡抑制剂),ferrostatin-1(促肥大症抑制剂),necrostatin-1(坏死性抑制剂),TBHQ和BHA(醌氧化还原酶诱导剂)却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是,单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察,发现长期培养后,微纤维从细胞中释放出来(图4Sd,e)。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白,并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞,并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此,由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异,研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型,与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a,b和S5所示,在DFY聚合后,确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白(倍数变化1.5和P <0.05,超几何测试)。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明,这些蛋白质大多数与细胞代谢(氨基酸代谢,糖代谢),能量供应(糖酵解,有氧呼吸)和蛋白质合成(核糖体)相关(图3c)。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能(图3d)。差异蛋白主要来自核糖体,线粒体,细胞核和高尔基体。此外,通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用(图3e)。来自细胞器的蛋白质,特别是核糖体,线粒体和细胞核中的蛋白质,形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质,从而导致这些蛋白质的显着减少。另外,作为专业的产生黑色素的细胞器,还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达(图S5)。GO富集分析的结果表明,用DFY处理后,黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析(PCA)分析了Cys含量,理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标(图3f),该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到,DFY处理可抑制线粒体功能,抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成(图S6)。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬,通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC(RAW264.7和DC)对DFY或pDFY的摄取(图4a,b)。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累,但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明,纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应,用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力(图4c)。与裂解物组相比,裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外,与裂解物+ pDFY相比,裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着(P = 0.0002)。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育,以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力(图4d),研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3%的B16细胞。相反,裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30%的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上,考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性,抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后,经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究,证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集,裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后,研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体(aPD1)或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠(图5a)实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91%的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率(图5c)。在所有组中,用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明,肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白,而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示,DFY + aPD1处理后,包括干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在内的免疫激活标记物增加(图5f)。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统,粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示,在相同深度下,用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度(MFI)高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比,DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍(图6h)。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力(图6i)。在为期16天的实验中,DFY @ gel显示出与DFY(腹膜内注射)相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比,评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中,研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统,该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞,该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时,通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核,线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白,这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后,肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来,形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此,设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC,并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性,并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中,发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
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