《小普课堂十六》
[哆啦A梦花心]【免疫组化知多少】

[伴我同行]什么是免疫组化？
根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应。以期望达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

[伴我同行]分类：
按标记物种类：免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤：直接法、间接法。
按结合方式：过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP）、卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP）。
我们按照标记物的种类，看一下常用的三种方法。
（见下图一）

免疫组化在DAB染色后一般有四种情况：阳性染色效果很好、阴性染色、染色弱阳性、非特异性染色等。

[伴我同行]染色结果阴性
抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。
抗原修复不全，换修复液或加强修复；对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合。
组织切片本身这种抗原含量低，设阳性对照片。
血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短。
细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
[桃花]小结：对于该问题，我们可以从以下思路进行分析。首先排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少；然后检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适；同时适当延长DAB的孵育时间，血清封闭时间也可适当缩短。

[伴我同行]染色弱阳性
固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量。
不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足。
抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足。
孵育抗体前切片上了过多的冲洗液。
孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。
[桃花]小结：改变固定方式及固定温度，寻找适当的抗原修复方式，判断抗体稀释度是否过高或延长孵育时间，切片确保水平放置等。

[伴我同行]组织切片非特异性染色
抗体孵育时间过长，抗体浓度高。
多抗易出现非特异性着色。
内源性过氧化物酶和生物素灭活不够。
非特异性组分与抗体结合，延长血清封闭时间。
DAB 孵育时间过长或浓度过高。
PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色。
标本染色过程中经常出现干片。
脱蜡不充分。
二抗与标本的内源性组织蛋白有交叉反应。
[桃花]小结：首先排除抗体孵育条件，接着判断DAB孵育时间是否太长以及血清封闭的时间，同时延长PBS冲洗的时间，增加次数等。#小普课堂#

Feliz cumpleaños, mi papá
你已经离开快5个月了，可是我每天都真的好想好想你，每天都在房间里躲起来一个人哭，每天都在不切实际的想着如果能让你活过来我愿意付出任何代价，每天都在想着我为什么没有早点把高数修完，这样就不用在暑假补课耽误和你的见面，我又为什么愚蠢的在补课和去见你当中选择了前者。我一直都在责怪我自己，可是没有用，一切都没有用，所有都已经无法挽回了。

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