凝胶电泳法
(1)原理:许多重要的生物大分子，如多肽核酸等都具有可解离的基团,在一定的 pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差
异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。(2)常见分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中的迁移率取决于所带电荷性质的差异以及分子的大小、形状的不同
#凝胶电泳法#
(1)原理:许多重要的生物大分子，如多肽核酸等都具有可解离的基团,在一定的 pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差
异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。(2)常见分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中的迁移率取决于所带电荷性质的差异以及分子的大小、形状的不同
#凝胶电泳法#
细胞的支原体检测——PCR 法
PCR 法是20 世纪80 年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验，其基本原理是酶促DNA 合成反应，即在DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA 聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格， 实验成本较高， 有时还会出现假阳性的现象。
（一）材料与设备
支原体PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。
（二）操作步骤
1 样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。
2 . 模板的制作。在无菌的条件下， 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子， 95 ℃ 水浴加热5min 。
3. 打开盖子，向管内加StrataClean Resin 10μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕， 4℃ 保存。
4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为50μl ， 反应用去离子水均需用紫外灯照射。
（1）在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。
（2）依次加入下列成分： 0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
（3） 加2μl 去离子水， 总体积45μl 。
（4）加5μl 己制成的模板到反应体系中。
（5） 阳性对照，内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。
（6） 取1支含有以上反应体系的离心管，加入5μl 去离子水作为阴性对照管。
（7） 在反应体系中加入100μl 矿物油。
（8）PCR 程序见表1 。
5.琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。
6.结果分析。该方法为检浏支原体的定性方法，在电泳泳道上， Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带， 当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染 。
有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。
（三）注意事项
PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。
注意假阳性、假阴性，有时需多次重复。
PCR 法是20 世纪80 年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验，其基本原理是酶促DNA 合成反应，即在DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA 聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格， 实验成本较高， 有时还会出现假阳性的现象。
（一）材料与设备
支原体PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。
（二）操作步骤
1 样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。
2 . 模板的制作。在无菌的条件下， 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子， 95 ℃ 水浴加热5min 。
3. 打开盖子，向管内加StrataClean Resin 10μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕， 4℃ 保存。
4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为50μl ， 反应用去离子水均需用紫外灯照射。
（1）在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。
（2）依次加入下列成分： 0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
（3） 加2μl 去离子水， 总体积45μl 。
（4）加5μl 己制成的模板到反应体系中。
（5） 阳性对照，内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。
（6） 取1支含有以上反应体系的离心管，加入5μl 去离子水作为阴性对照管。
（7） 在反应体系中加入100μl 矿物油。
（8）PCR 程序见表1 。
5.琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。
6.结果分析。该方法为检浏支原体的定性方法，在电泳泳道上， Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带， 当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染 。
有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。
（三）注意事项
PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。
注意假阳性、假阴性，有时需多次重复。
#慕梓的电子日记簿[超话]#
D44 12. 12周日
给p3小鼠洗笼子，换垫料
给所有小鼠加水
提取DNA第二天。提取基因型说明书见p1p2.
主要是离心机的使用......
PCR
把程序p4设置好后就可以去制胶准备跑琼脂糖凝胶电泳了
20μL的反应体系，配方见p3
琼脂糖凝胶电泳
①制胶
1.5%的琼脂糖-1×TAE溶液，
微波炉高热-2min，加热1min后拿出来摇一下，然后每20s（沸腾起来）摇一下
加核酸染料，100mL的溶液加10μL核酸染料。⚠️枪头伸进液面以下加，节省资源[单身狗]
摇匀，直到核酸染料完全染匀
插梳子
从梳子的另一侧把溶液缓缓倒进去，如果有气泡，赶走它
等它凝固，30min以上，等PCR跑完就可以了
②电泳
电泳槽里加1×TAE，把胶放进去，胶板背面那些脏东西丢掉，电泳液要没过胶的表面。⚠️注意胶的方向，DNA都是从负极往正极跑，所以有孔的那一面放在近负极端。
加样 先加marker！可以有效检查胶有没有什么问题，以免浪费样品
合上盖子，注意为防止短路，把电源接触的地方擦干。
正负极一定不要接反
开机子，120V以上，140左右，正计时，一般半个小时左右就可以了，只要条带能跑出来，跑到胶的一半就行
③看结果
同时开第一和第二个紫外灯
一般把上样的那边放在近门口的一边
今天的结果见p5p6
最下面那四个是我的小鼠的，最后一个的第一对引物没跑出来，即缺失
D44 12. 12周日
给p3小鼠洗笼子，换垫料
给所有小鼠加水
提取DNA第二天。提取基因型说明书见p1p2.
主要是离心机的使用......
PCR
把程序p4设置好后就可以去制胶准备跑琼脂糖凝胶电泳了
20μL的反应体系，配方见p3
琼脂糖凝胶电泳
①制胶
1.5%的琼脂糖-1×TAE溶液，
微波炉高热-2min，加热1min后拿出来摇一下，然后每20s（沸腾起来）摇一下
加核酸染料，100mL的溶液加10μL核酸染料。⚠️枪头伸进液面以下加，节省资源[单身狗]
摇匀，直到核酸染料完全染匀
插梳子
从梳子的另一侧把溶液缓缓倒进去，如果有气泡，赶走它
等它凝固，30min以上，等PCR跑完就可以了
②电泳
电泳槽里加1×TAE，把胶放进去，胶板背面那些脏东西丢掉，电泳液要没过胶的表面。⚠️注意胶的方向，DNA都是从负极往正极跑，所以有孔的那一面放在近负极端。
加样 先加marker！可以有效检查胶有没有什么问题，以免浪费样品
合上盖子，注意为防止短路，把电源接触的地方擦干。
正负极一定不要接反
开机子，120V以上，140左右，正计时，一般半个小时左右就可以了，只要条带能跑出来，跑到胶的一半就行
③看结果
同时开第一和第二个紫外灯
一般把上样的那边放在近门口的一边
今天的结果见p5p6
最下面那四个是我的小鼠的，最后一个的第一对引物没跑出来，即缺失
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