8.3
早起✅
单词1个part✅
练字✅
韩刚译文3篇✅
英语听力✅
阅读❎️
今天被一群婆婆围着讨论我的身材,感觉语言中委婉地透露着我不能再胖了的语气[允悲][允悲][允悲]
今早上去外边吃的牛肉面,味道不错,这个假期第一次耶……真是没想到
今天看到几句话,觉得很有道理:
“学会专注,万事各得其所”
“越没有人爱你,越要爱你自己”
“在沉默中努力,让沉默发声”
“一切都会过去的”
今天吃了三个面包 ,有点罪恶
今天听了 的新歌,好听!希望他越来越好❤
加油,一切都会好起来的

大家好,我是你们的科普达人小V,上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点,这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理:

凋亡早期,细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从膜内翻到膜外,这是凋亡的一个典型特征,细胞凋亡处于早期阶段时,仅有PS外翻,而细胞膜仍然完整,随着凋亡进程的推移,细胞除了PS外翻以外,细胞膜通透性会改变,可以简单的理解成凋亡后期,细胞膜有穿孔的现象。

接下来我们再来看一下试剂,我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例,试剂盒内一般都是3个组分:两个染料,再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下,能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白,通过在该蛋白上标记的荧光基团,我们就可以标记凋亡细胞了,然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料,就可以达到区分各阶段细胞的目的了。

我们将细胞分为三类:一是无PS外翻,也没有细胞膜破裂的健康细胞(两个染料都染不上),二是处于早期凋亡,有PS外翻但是细胞膜完好的细胞(可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI),三是处于晚期凋亡阶段,既存在PS外翻,也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞(两种染料均可染上),第四类较为特殊,不做赘述,它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞,一般认为这是坏死细胞(可以染上PI,但是无法染上Annexin V-FITC)。
染完色后通过流式细胞仪,我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。

以上就是Annexin V法检测凋亡的原理,怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身,如何顺利的攻克这个检测呢?

硬核技术一:
细胞收集与染色——如何规范化操作?
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪,因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品,悬浮细胞直接计数,贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作;如果样本是组织,那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了,可以概括成以下几步:
(1) 细胞收集,PBS洗涤
(2) Binding Buffer重悬
(3) 染色
(4) 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤,洗涤时用预冷的PBS洗两遍,然后将PBS吸干净,用Binding Buffer重悬后进行染色,染色时两种染料各加5 µl,避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家,染色时间不建议延长,避免造成假阳性影响实验结果分析。

硬核技术二:
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办?
流式的对照一直很令人头疼,今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外,还需要添加一系列的对照,用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
(1) 空白对照:不进行标记的裸细胞,一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后,细胞本身物理状态是否有变化,也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
(2) 阴性对照:双染的不处理正常细胞,目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外,健康细胞分界线确定建议用这个对照,因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
(3) 单标组:单一染料标记的实验组细胞(有凋亡细胞)。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中,荧光信号除了接收通道以外,还可能被另一通道接收到,影响该通道的数据,因此需要进行“补偿调节”,扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管,所使用样本应该是该染料检测时,细胞能够有明显区分度的样本。

硬核技术三:
数据分析——救救孩子,怎么搞分析啊?
流式数据的分析是这个实验的重中之重了,我们应该如何操作,才能够得到漂亮的图呢?
首先,我们来认识一下流式分析的检测原理:流式细胞仪通道中一个个的样本流过,仪器会给它一个激发光,这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收,反映在图上就是下图所示的一个个小点(smooth图不以小点的形式显示),这边需要强调的是,流式通道一个个通过去的样品,不一定全是细胞,体系内的细胞碎片,各种小分子杂质只要能够被流式检测到,反映在图谱上,就是一个点。所以严格来说,流式图谱中的点,每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件,我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。

凋亡数据分析有三个重要步骤:画门、调补偿、画十字门。

1、画门
流式分析给出的第一个图谱,是FSC-SSC物理图谱(图a),这边是小V做的一个凋亡细胞样品,使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色,上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱,这是之后所有分析的基础。

横纵坐标轴FSC(前向角散射)和SSC(侧向角散射)分别代表了细胞大小和细胞颗粒度,通过这个图谱,我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用,一是如果两种细胞群在一起,细胞有明显的形态区别,可以做初步的分类,另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片,如图a所示,我们能够看到很明显的两个群,右上方一群,左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体,这一群与右上群体具有明显区分度的事件,被判定为细胞碎片,是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢?
大家可以看图b和图d,图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果,图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多,细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下:细胞碎片,请尽力把它排除出你的分析范围!!!
好了,告一段落,搞定了基础的FSC-SSC图谱,成功选到了我们要分析的细胞,也就是做好了第一步:画门。我们接下来应该做什么呢?

2、调补偿

现在的流式细胞仪,调补偿的方法各有不同,有直接上机的时候跑个单染管,仪器自动给你调整好的,也有仪器万事不管,你自己跑完所有样本,回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了,我们来讲一讲后者。
首先,必须调节补偿,细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外,还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子,大家可以看下边这个表格:目标接收通道FL1只能接收到80 %的光,还有20 %散布在其他通道,FL2通道高达10 %,因此不扣除这部分荧光,对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作,就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光,就要准备几种单染管!!

唠完前边这些理论内容,我们来说点实在的。在凋亡实验中,我们如何来调节荧光补偿呢?
这边小V推荐大家拿到原始数据以后,用Flowjo V10进行荧光补偿的调节,软件自动,不用发愁~这个操作分为3步
(1) 在FSC-SSC图中,选出待分析细胞群,一定尽量扔掉细胞碎片!
(2) 打开Flowjo的补偿调节界面,按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择,大家不用在意,请重点关注Sample和Negative,Sample是你的单染管,Negative指的是不含该染料的体系,一般统一用不染色的对照组就行了。
(3) 请点击Apply to Group按钮,选中对应的数据组,简单模式的你的补偿就已经OK了~

3、画十字门

最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
 
我们通过十字门,将细胞分为了四个象限(见图4),分别对应了四种不同的染色情况,左下象限是两个染料都没染到的健康细胞,右下是染上了Annexin V-FITC,没染上PI的早期凋亡细胞,右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞(FITC和PI都能染上),但实际情况中,右上象限也是包括了一部分坏死细胞的,但是比例比较小,一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞(不经凋亡,因此没有PS外翻,但是细胞坏死后细胞膜损坏,因此核酸染料可以进入)。
讲完了结果的四个象限划分,我们回到四个象限本身,这个十字门该怎么画呢?
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据,找出两个单染组,然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界,然后在双染的数据中以这两个分界为基准,结合数据的实际分群情况进行微调,就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下,需要一起分析的数据们,都必须用统一的十字门哟!

最后,有几个点需要补充说明一下,也是大家经常遇到的一些问题:
1. 我的细胞贴壁非常的厉害,不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟,怎么办?
遇到这种情况,小V建议你两害相权取其轻,Binding Buffer里最重要的组分是钙离子,建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来,降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久,会引入很多机械性损伤,对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的,但是后续一定要洗涤干净。

2. 我能不能延长染色时间啊?我觉得10分钟染色,好像染得不够多啊?
不可以的哦,10分钟是最优化的染色时间,染色时间过长的情况下会产生假阳性,不利于真实的实验结果分析。

3. 我的细胞因为种种原因,就是没办法好好分群,我该怎么画门呢?
这里首先要同情一下这位同学,然后要告诉大家,遇到这种情况,可做一个健康细胞双染(同一份健康细胞,加染料与不加染料,其本底荧光值会有偏移,因此这边必须进行双染),健康细胞肯定是染不上染料的,那么你就得到了一团在左下角的细胞,以一团细胞的边界为标准画十字门,然后统一用这个十字门就可以了。

4. 我这边没有流式,我该在哪里停止实验啊?
收集好细胞后,经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬,放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长,否则细胞状态容易变差。

友情提醒:如果细胞本身凋亡就非常多,那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断,建议针对不同实验条件开展优化。

好啦~今天的课小V就讲到这里了,如果大家在实验方面有任何疑问, 欢迎随时咨询小V,或直接联系您身边的诺唯赞人,我们将努力为您提供更优质的产品和服务!最后,祝福大家实验顺当结果好,细胞超乖不作妖!

【实相】是什么意思?实相的意思
转载

持诵地藏经仪轨佛珠需要开光吗?怎么开光?佛教三世因果文持诵地藏经仪轨佛珠需要开光吗?怎么开光?

实相是什么意思?实相的意思
  实相即无相,就是本来的样子,真实的样子,无有本体。凡所有相,皆是虚妄,惟此独实,不变不坏。又名佛性、法性、真如、法身、真谛等。实相即是非一切相,所以如来说以非一切相之本相,不执求、不住着,即名为实相。佛法要从无相里认识实相,因为有相都是假相。
  人人都有一个本来面目,或说真心、佛心、实相、般若、法身,看起来名称很多,实际上意义只是一个。例如,这是个房子,房子是假相,它真实的实相是由土、水泥、石子、沙、木材、人工等和合而成。
  我们的内在都具备有一个真实的佛性,其中有很大的功德。只是这个真我,往往我们自己不知道、不认识。这是什么?这是花,那是衣服、手巾、茶杯、书,这个人是张三,那个人是李四,我们认识了很多的假相,但是我们不能认识无相。无相才是实相,有相都是假相。《金刚经》里说:“凡所有相,皆是虚妄。”
各法师对“实相”的解释
  实相的意思(广钦老和尚)
  实相就是离一切虚妄之相的真实相状,也叫作真如、圆觉,自性……等等。当我们依法实践,妄心逐步息下后,真实之相便得现。
  实相的意思(宏海法师)
  实相,顾名思义就是一切事物万事万物的真实相态,即它本来就是这个样子。我们在理解实相的时候,首先要明了我们现在所认知、所呈现出来的,都是虚相,立足于凡夫的本位而言。那么修学佛法就是要从这个虚相转为悟到这个实相,证到这个实相。在虚相的时候我们是颠倒的、有漏的、杂染的、凡夫的,悟到实相以后就是无漏的,是清净的,是圣者的智慧。
  实相的意思(净宗法师)
  所谓实相,就是真实之相。佛教里经常说“诸法实相”,又说“唯佛与佛,乃能究尽诸法实相”。一切万法的真实本相是什么?又叫真如实相。我们可以从另外一个词——“假象”来理解,比如说一个人做了案,然后他摆了一个迷魂阵,我们说这是假象,迷惑住了。佛法所讲的实相,是究竟深入层面上讲的。
  比如我们看见人,就有男相女相;看见物品,看见一枝花,花有花之相,看见一片叶子,叶子有叶子之相。但我们凡人就会被这表面上的现象所迷惑,认为“这是红花,这是绿叶”,好啦,坏啦,美了,丑了,这些都不是万法的真实之相。万法的真实之相就是本来寂灭,就是真如。寂灭就是不生不灭。我们看见的一切万法都是生生灭灭。
  所谓实相,可以叫作“寂灭相”,也叫作“平等相”,诸法平等,无有高下,一切万法的体性都是空性、平等。所以我们见到的差别,高下大小,美丑善恶,这些都是假象,不是真相,当然也就不是实相。这也是名词的理解。
各辞典对“实相”的解释
  《俗语佛源》的解释
  实相,指宇宙事物的真相或本然状态。佛家还指出,实相也就是无相、空相,如《金刚经》所说:“凡所有相,皆是虚妄。”《法华经·方便品》:“惟佛与佛,乃能究尽诸法实相。”如《初刻拍案惊奇》卷二二:“话说人间荣华富贵,眼前的多是空花,不可认为实相。”又如清·龚自珍《妙法莲华经四十二问》:“佛不坏假名而说实相。”后指真实情形,如章炳麟《驳康有为论革命书》:“此正满洲行政之实相也。”(文贤)
  《佛学大辞典》的解释
  (术语)实者,非虚妄之义,相者无相也。是指称万有本体之语。曰法性,曰真如,曰实相,其体同一也。就其为万法体性之义言之,则为法性;就其体真实常住之义言之,则为真如;就此真实常住为万法实相之义言之,则为实相。其他所谓一实,一如,一相,无相,法身,法证,法位,涅槃,无为,真谛,真性,真空,实性,实谛,实际,皆是实相之异名。又依名随德用之三谛言之,则空谛为真如,假谛为实相,中谛为法界。法华说实相,华严说法界,解深密说真如或无为,般若说般若佛母,楞伽说如来藏,涅槃说佛性,阿含说涅槃。在华严之始教天台之通教已下者,不变之空真如为实相,在华严之终教已上,天台之别教已上者,不变随缘之二相为实相。华严以随缘之万法为实相,天台真言以性具之诸法为实相,小乘以我空之涅槃,大乘以我法二空之涅槃为实相。维摩经弟子品曰:“迦旃延无以生灭心行说实相法。”同观众生品曰:“佛为实相法人。”涅槃经四十曰:“无相之相,名为实相。”妙玄二上曰:“实相之境,非佛天人所作,本自有之,非遍今也。”法华文句记四中曰:“言实相者,非虚故实。非相为相,故名实相。”顿悟入道要门论上曰:“法性空者,即一切处无心是。若得一切处无心时,即无有一相可得。何以故?为自性空故无一相可得,无一相可得者,即是实相,实相者,即是如来妙色身相也。”
  《中国大百科全书》的解释
  佛教术语。一切诸法的真实体相,又名诸法实相。实、谓真实不虚,相谓事物的本性或相状,是佛教所说的绝对真理。佛教认为,宇宙间一切事物都是因缘(条件)组成、变化无常的,都没有永恒的、固定不变的自体,这就是“空”。这种空就是宇宙万有的“真性”,亦即诸法实相。《思益经》卷一称:“诸法从缘生,自无有定性,若知此因缘,则达法实性。”《大涅槃经》卷四十:“无相之相,名为实相。”《中论·观法品》:“诸法毕竟空,不生不灭,名诸法实相。”诸法实相为万有的本性,所以又叫“法性”,此法性真常不变,所以又名真如。此外还有真谛、中道、涅槃、实际、实性、法身、法界、佛性、如来藏、般若等种种异名。《肇论·宗本义》:“本元、实相、法性、性空、缘会,一义耳。”佛教各派对实相的解释各有不同,三论宗以“无依无得”的空理为诸法实相;天台宗以“一念三千”、“三谛圆融”的性具说为诸法实相;华严宗以随缘之真如为诸法实相;法相宗以“圆成实性”为诸法实相。小乘以“我空”之涅槃为实相;大乘则以“我空”、“法空”之涅槃为实相。(刘峰)
  《唯识名词白话新解》的解释
  原义为本体、实体、真相、本性等;引申指一切万法真实不虚之体相,或真实之理法、不变之理、真如、法性等。此系佛陀觉悟之内容,意即本然之真实,举凡一如、实性、实际、真性、涅槃、无为、无相等,皆为实相的异名。实相超越一切相对相,超越一切语言效用,因为一切语言都是相对性,而实相则是绝对的真理。
  佛教的基本理论是“缘起”,缘起,即是众多因素条件,关涉对待而起。缘起有其纵向的关涉对待的关系、和其横向的关涉对待的关系。自纵向的时间上看,是前因后果的关系,自横向的空间上看(就时间某一点上看),是彼此对待的关系。所以,“此生故彼生,此灭故彼灭。”是时间上的因果关系;“此有故彼有,此无故彼无。”是空间上的对待关系。诸法以因缘对待而生起,自然没有独立的自性(即没有固定的不变之性)所以在时间上有生、住、异、灭四相。以有生灭,所以“无常”;而众多因素条件生起的事物,没有中心的主体,无主体所以“无我”。诸法无常、无我,故其本性是空——即是“空性”或“性空”,所以“空性”是诸法的本质,是本来如此的、不增不减的法性,此法性即是诸法实相,亦即是真如。 https://t.cn/RJPaBcs


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