这个宇宙是藉着神的话造成的。所以有看得见的，是从那位看不见的造出来的？谁呢？基督。约翰福音1章3节，约翰说：「万物是藉着祂造的；凡被造的，没有一样不是藉着祂造的。」神藉着基督创造诸世界。
而神要显明唯独祂是神，除祂以外再无神，就启示这一切是祂造成的。以赛亚书40章25-26节，那圣者说：「你们将谁比我，叫他与我相等呢？你们向上举目，看谁创造这万象，按数目领出，他一一称其名；因他的权能，又因他的大能大力，连一个都不缺。」
耶利米书32章17节，先知耶利米说：「主耶和华啊，你曾用大能和伸出来的膀臂创造天地，在你没有难成的事。」
以赛亚书42章8节，神说：「我是耶和华，这是我的名；我必不将我的荣耀归给假神，也不将我的称赞归给雕刻的偶像。」17节，神说：「倚靠雕刻的偶像，对铸造的偶像说：你是我们的神；这等人要退后，全然蒙羞。」
以赛亚书44章8节，神说：「除我以外，岂有真神吗？诚然没有磐石，我不知道一个！」9节：「制造雕刻偶像的尽都虚空；他们所喜悦的都无益处；他们的见证无所看见，无所知晓，他们便觉羞愧。」这些制造神像，铸造偶像的，无非想得到益处，造它们的工匠也不过是人。
以赛亚书44章14-17节：「他砍伐香柏树，又取柞[或译：青桐]树和橡树，在树林中选定了一棵。他栽种松树，得雨长养。这树，人可用以烧火；他自己取些烤火，又烧着烤饼，而且做神像跪拜，做雕刻的偶像向它叩拜。他把一分烧在火中，把一分烤肉吃饱。自己烤火说：“啊哈，我暖和了，我见火了。”他用剩下的做了一神，就是雕刻的偶像。他向这偶像俯伏叩拜，祷告它说：“求你拯救我，因你是我的神。”」
人的糊涂莫过于此！一块木头，可能被作成板凳，或者丢在火里当柴烧，而人竟然把它做成神像，向它俯伏叩拜、祷告。以赛亚书44章18节，神说：「他们不知道，也不思想；因为耶和华闭住他们的眼，不能看见，塞住他们的心，不能明白。」保罗说：「他们的思念变为虚妄，无知的心就昏暗了；自称为聪明，反成了愚拙。」宁可去敬拜事奉受造之物，也不敬奉那造物的主。神就任凭他们。只有真神能够创造，并且指示人这一切是祂造的。
第二、只有真神能够启示，向人说话。以赛亚书46章9-10节，神说：「你们要追念上古的事。因为我是神，并无别神；我是神，再没有能比我的。我从起初指明末后的事，从古时言明未成的事，说：我的筹算必立定；凡我所喜悦的，我必成就。」
以赛亚书41章21-24节，耶和华对假神说：「你们要呈上你们的案件；雅各的君说：你们要声明你们确实的理由。可以声明，指示我们将来必遇的事，说明先前的是什么事，好叫我们思索，得知事的结局，或者把将来的事指示我们。要说明后来的事，好叫我们知道你们是神。你们或降福，或降祸，使我们惊奇，一同观看。看哪，你们属乎虚无；你们的作为也属乎虚空。那选择你们的是可憎恶的。」假神不能指明将来的事，它不能降祸，也无力降福。
第三，从审判。在《使徒信经》一开始就宣告：「我信上帝，全能的父，创造天地的主。」又提到基督和祂的降临，以及审判。创世记18章25节，亚伯拉罕说：「审判全地的主，岂不行公义吗？」表示在亚伯拉罕的信心里面，知道神会审判全地。这样，只有创造万有，按公义审判世界，随自己的旨意行事，指明历史的动向的这位才是神。
如果你向神心存诚实，你不需要寻找祂，祂正在寻找你。亚伯拉罕在主面前作我们众人的父，为我们立下了信心的典范。摩西在带领以色列百姓的过程中，恒心忍耐，如同「看见」那不能看见的主。摩西没有日日忧虑，没有连夜间心也不安，因为他不是凭自己，而是仰望神。
你说：「我很想知道我所要走的每一步路，如果能看清楚整个路途，我就放心了。」弟兄姐妹，「知道带领我们的是谁」，比知道「我们所要走的每一步路」更加重要。在看不见任何陆地的大海上，你要看太阳，或是藉着星星定自己的方位；不是看地上，是看天上。你若信神，就能看见神的荣耀，就能看见神的作为。你若信神，就能看见神的应许绝对不落空。
神向摩西启示祂的名字是「耶和华」，是在自己有生命的永生神。诗篇90篇1-2节，摩西说：「主阿，你世世代代作我们的居所。诸山未曾生出，地与世界你未曾造成，从亘古到永远，你是神。」
神超越时间，同时又以祂的永恒介入每一时每一刻。祂会为自己名的缘故在我们生命中施展大能。祂不会背弃祂的约，因为祂是「守约施慈爱」的神，祂既然说了，就一定会做到。为这个缘故，我们可以好好享受在神里面的安稳，以神的信实为粮。
神的眼目早已看见将来必成的事，祂既然已经指示就必成就。而在我们明白神会怎么做之前，要有信心和胆量，相信神的全能。当面临试炼和困局，不知道前面的路该怎么走的时候，要知道「信心」就是一种看见。
亚伯拉罕因着信，蒙召的时候就遵命出去，往将来要得为业的地方去，出去的时候，还不知往哪里去；好像失去了保障，失去了安全感，但他相信神一定会引导他，亚伯拉罕要做的，就是「竭尽所能」的信靠神，大胆走上自己不知道的路。
伦敦圣经学院院长章伯斯说：「作神的工，其中一个难题就是，你根本不知道该做什么，你唯一知道的，是神知道祂在做什么。」信心的根源是出于「对神的认识」。虽然暂时不知道要往哪里去，不知道神会怎么带领我，但我却知道而且深爱领路的神。
为什么神不让我们知道前面所有的路呢？因为神要我们见证祂的信实。一个对神有信心的人，就肯遵命出去，并且对神所作的一切，一点也不诧异。神必信守祂所给过的承诺，必要的时候祂会介入、干预。诗篇105篇14-15节，诗人说：「祂不容什么人欺负他们，为他们的缘故，责备君王，说：“不可难为我受膏的人，也不可恶待我的先知。”」
信心是神赐给我们的无价产业。我们可以因着信，把未知的将来，交托给那位全知的主。神知道怎么经营、怎样建造，那座「有根基的城」，我们要做的是信赖祂，并且时时跟祂互动。
弟兄姊妹，让我们省察，今天是否我们急于知道「所要走的每一步路」，过于认识「带领我们的神」？透过今天的信息，让我们再一次思想亚伯拉罕的顺服，思想摩西如何因着信，恒心忍耐，如同看见那不能看见的主。
愿主帮助我们，因为知道一切事情都掌握在祂手中，祂的心里有蓝图，祂为我们预备的是「恩典之路」，祂的带领对我们永远是最美、最好的，能够奋勇向前，为神要成就的美事，感谢、赞美祂。
主啊，你用权能的命令托住万有，你也是人类历史的主宰，你从起初就指明未来的事和将要发生的事。地的柱子属于你；你将世界立在其上。亚伯拉罕信你是全能者，他对你的应许总是欢喜迎接。当他蒙召往将来要得为业的地方去，出去的时候，还不知往那里去，但他信赖你，而你也喜悦他，把他当作是你的朋友。他一生经历你的慈爱和能力，见证你是使死人复活，使无变为有的神。求主帮助我们都能像亚伯拉罕那样，拥抱你永不迟延的应许。当你的引导来到时，帮助我们不因为胆怯，或裹足不前而错失经历你的良机。愿你活泼的灵继续带领我们，用你真理建立我们，使我们深知所信。祷告祈求奉耶稣基督的圣名。阿们。
而神要显明唯独祂是神，除祂以外再无神，就启示这一切是祂造成的。以赛亚书40章25-26节，那圣者说：「你们将谁比我，叫他与我相等呢？你们向上举目，看谁创造这万象，按数目领出，他一一称其名；因他的权能，又因他的大能大力，连一个都不缺。」
耶利米书32章17节，先知耶利米说：「主耶和华啊，你曾用大能和伸出来的膀臂创造天地，在你没有难成的事。」
以赛亚书42章8节，神说：「我是耶和华，这是我的名；我必不将我的荣耀归给假神，也不将我的称赞归给雕刻的偶像。」17节，神说：「倚靠雕刻的偶像，对铸造的偶像说：你是我们的神；这等人要退后，全然蒙羞。」
以赛亚书44章8节，神说：「除我以外，岂有真神吗？诚然没有磐石，我不知道一个！」9节：「制造雕刻偶像的尽都虚空；他们所喜悦的都无益处；他们的见证无所看见，无所知晓，他们便觉羞愧。」这些制造神像，铸造偶像的，无非想得到益处，造它们的工匠也不过是人。
以赛亚书44章14-17节：「他砍伐香柏树，又取柞[或译：青桐]树和橡树，在树林中选定了一棵。他栽种松树，得雨长养。这树，人可用以烧火；他自己取些烤火，又烧着烤饼，而且做神像跪拜，做雕刻的偶像向它叩拜。他把一分烧在火中，把一分烤肉吃饱。自己烤火说：“啊哈，我暖和了，我见火了。”他用剩下的做了一神，就是雕刻的偶像。他向这偶像俯伏叩拜，祷告它说：“求你拯救我，因你是我的神。”」
人的糊涂莫过于此！一块木头，可能被作成板凳，或者丢在火里当柴烧，而人竟然把它做成神像，向它俯伏叩拜、祷告。以赛亚书44章18节，神说：「他们不知道，也不思想；因为耶和华闭住他们的眼，不能看见，塞住他们的心，不能明白。」保罗说：「他们的思念变为虚妄，无知的心就昏暗了；自称为聪明，反成了愚拙。」宁可去敬拜事奉受造之物，也不敬奉那造物的主。神就任凭他们。只有真神能够创造，并且指示人这一切是祂造的。
第二、只有真神能够启示，向人说话。以赛亚书46章9-10节，神说：「你们要追念上古的事。因为我是神，并无别神；我是神，再没有能比我的。我从起初指明末后的事，从古时言明未成的事，说：我的筹算必立定；凡我所喜悦的，我必成就。」
以赛亚书41章21-24节，耶和华对假神说：「你们要呈上你们的案件；雅各的君说：你们要声明你们确实的理由。可以声明，指示我们将来必遇的事，说明先前的是什么事，好叫我们思索，得知事的结局，或者把将来的事指示我们。要说明后来的事，好叫我们知道你们是神。你们或降福，或降祸，使我们惊奇，一同观看。看哪，你们属乎虚无；你们的作为也属乎虚空。那选择你们的是可憎恶的。」假神不能指明将来的事，它不能降祸，也无力降福。
第三，从审判。在《使徒信经》一开始就宣告：「我信上帝，全能的父，创造天地的主。」又提到基督和祂的降临，以及审判。创世记18章25节，亚伯拉罕说：「审判全地的主，岂不行公义吗？」表示在亚伯拉罕的信心里面，知道神会审判全地。这样，只有创造万有，按公义审判世界，随自己的旨意行事，指明历史的动向的这位才是神。
如果你向神心存诚实，你不需要寻找祂，祂正在寻找你。亚伯拉罕在主面前作我们众人的父，为我们立下了信心的典范。摩西在带领以色列百姓的过程中，恒心忍耐，如同「看见」那不能看见的主。摩西没有日日忧虑，没有连夜间心也不安，因为他不是凭自己，而是仰望神。
你说：「我很想知道我所要走的每一步路，如果能看清楚整个路途，我就放心了。」弟兄姐妹，「知道带领我们的是谁」，比知道「我们所要走的每一步路」更加重要。在看不见任何陆地的大海上，你要看太阳，或是藉着星星定自己的方位；不是看地上，是看天上。你若信神，就能看见神的荣耀，就能看见神的作为。你若信神，就能看见神的应许绝对不落空。
神向摩西启示祂的名字是「耶和华」，是在自己有生命的永生神。诗篇90篇1-2节，摩西说：「主阿，你世世代代作我们的居所。诸山未曾生出，地与世界你未曾造成，从亘古到永远，你是神。」
神超越时间，同时又以祂的永恒介入每一时每一刻。祂会为自己名的缘故在我们生命中施展大能。祂不会背弃祂的约，因为祂是「守约施慈爱」的神，祂既然说了，就一定会做到。为这个缘故，我们可以好好享受在神里面的安稳，以神的信实为粮。
神的眼目早已看见将来必成的事，祂既然已经指示就必成就。而在我们明白神会怎么做之前，要有信心和胆量，相信神的全能。当面临试炼和困局，不知道前面的路该怎么走的时候，要知道「信心」就是一种看见。
亚伯拉罕因着信，蒙召的时候就遵命出去，往将来要得为业的地方去，出去的时候，还不知往哪里去；好像失去了保障，失去了安全感，但他相信神一定会引导他，亚伯拉罕要做的，就是「竭尽所能」的信靠神，大胆走上自己不知道的路。
伦敦圣经学院院长章伯斯说：「作神的工，其中一个难题就是，你根本不知道该做什么，你唯一知道的，是神知道祂在做什么。」信心的根源是出于「对神的认识」。虽然暂时不知道要往哪里去，不知道神会怎么带领我，但我却知道而且深爱领路的神。
为什么神不让我们知道前面所有的路呢？因为神要我们见证祂的信实。一个对神有信心的人，就肯遵命出去，并且对神所作的一切，一点也不诧异。神必信守祂所给过的承诺，必要的时候祂会介入、干预。诗篇105篇14-15节，诗人说：「祂不容什么人欺负他们，为他们的缘故，责备君王，说：“不可难为我受膏的人，也不可恶待我的先知。”」
信心是神赐给我们的无价产业。我们可以因着信，把未知的将来，交托给那位全知的主。神知道怎么经营、怎样建造，那座「有根基的城」，我们要做的是信赖祂，并且时时跟祂互动。
弟兄姊妹，让我们省察，今天是否我们急于知道「所要走的每一步路」，过于认识「带领我们的神」？透过今天的信息，让我们再一次思想亚伯拉罕的顺服，思想摩西如何因着信，恒心忍耐，如同看见那不能看见的主。
愿主帮助我们，因为知道一切事情都掌握在祂手中，祂的心里有蓝图，祂为我们预备的是「恩典之路」，祂的带领对我们永远是最美、最好的，能够奋勇向前，为神要成就的美事，感谢、赞美祂。
主啊，你用权能的命令托住万有，你也是人类历史的主宰，你从起初就指明未来的事和将要发生的事。地的柱子属于你；你将世界立在其上。亚伯拉罕信你是全能者，他对你的应许总是欢喜迎接。当他蒙召往将来要得为业的地方去，出去的时候，还不知往那里去，但他信赖你，而你也喜悦他，把他当作是你的朋友。他一生经历你的慈爱和能力，见证你是使死人复活，使无变为有的神。求主帮助我们都能像亚伯拉罕那样，拥抱你永不迟延的应许。当你的引导来到时，帮助我们不因为胆怯，或裹足不前而错失经历你的良机。愿你活泼的灵继续带领我们，用你真理建立我们，使我们深知所信。祷告祈求奉耶稣基督的圣名。阿们。
大家好,我是你们的科普达人小V，上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点，这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
你一句玩笑的话去找张爽吧。
我终于让我最爱丢人两个人见面了。
有些许的担心，怕你们会吵起来。
但，大家初次见面嘛，还是比较客气的。
店里冷气开的太足，我穿上了你的鞋子。
吃过饭后你帮我扣鞋带，其实我总是会被一些细小的细节而感动。
而闺蜜说看着不像我们之间发生了这么多事儿的人。但毕竟不熟所以，还是不了解。
我们一起去唱个……
回家路上，我也是晕乎乎的，有你在感觉就特别好，我忘记我们多久没在一起了，总觉得我们可以分开很久了。
我只知道我是真的想你了。
坐在车里，我抱着你哭了。
我是觉得你始终不属于我，我觉得的你的心在慢慢离开我。我担心，我们不能在一起。
无论我多努力！也不能……
你说你只想我属于你一个人，我也一样～
我终于让我最爱丢人两个人见面了。
有些许的担心，怕你们会吵起来。
但，大家初次见面嘛，还是比较客气的。
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吃过饭后你帮我扣鞋带，其实我总是会被一些细小的细节而感动。
而闺蜜说看着不像我们之间发生了这么多事儿的人。但毕竟不熟所以，还是不了解。
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回家路上，我也是晕乎乎的，有你在感觉就特别好，我忘记我们多久没在一起了，总觉得我们可以分开很久了。
我只知道我是真的想你了。
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无论我多努力！也不能……
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