丰胸、哺乳、防癌，乳房保健究竟有多少误区？
药物丰胸需谨慎
女性都会关注怎么做能让乳房更健康美观，乳房保健按摩因为其简便易行的特点颇受广大女性朋友的喜爱，下面我们就来介绍一下乳房保健按摩的方法和注意事项。
乳房保健按摩
乳房保健按摩可以加强胸部血液循环，有助于局部的新陈代谢，同时使交感和副交感神经系统活跃。
从中医角度来看，乳房周围有肾经、胃经、肝经、脾经等经络通过，按摩点穴是促进乳房健美的好方法，所以每天临睡前或早晨醒来后不妨仰卧在床按摩乳房。
【操作方法】 双手像乳房自检那样在双乳周围有节奏地自我旋转按摩，直到乳房皮肤微红微热为止。
若因情志不遂引起了胸闷、乳房胀痛，可用掌根缓缓旋转按揉肝经章门穴所在的胁肋部，力度以微痛为度，一圈配合一次深呼吸，49 下可缓解 ；月经期乳房胀痛者在睡前按摩上述穴位，并用双掌根相叠旋转按揉任脉上的膻中穴、关元穴，一圈配合一次深呼吸，每个位置 49 次。
除了乳房保健按摩以外，女性朋友还喜欢选用一些外用或内服的药物来丰胸，在此笔者提醒大家注意以下几点。
【外用 ：丰乳霜与精油】
大城市乳房保养精油按摩很盛行，广告常宣传其可以使皮肤白皙细腻，乳房丰满。
其实，很多丰胸产品都有可能含有激素添加剂，其丰胸效果越明显，隐藏的风险也越大。
而且，雌激素引起的乳房变化只是一时之效，外源性雌激素会影响体内雌激素的分泌，一旦停用，反弹会很严重 ；若长期使用导致雌激素过量，则可能会发生色素沉着、乳腺增生疼痛、乳腺纤维瘤等，月经也会受影响，还会增加乳腺癌的风险。
除了要注意丰胸产品中的成分以外，有乳腺疾病的患者，或使用后乳房明显肿胀者对于精油、丰乳膏推拿也应尽量避免。
【内服 ：乳腺保健食品】
那么，维生素 E 和蜂王浆等受到女性欢迎的保健品是否对乳腺保健有益呢？维生素 E 能促进性激素分泌，蜂王浆内的活性成分能够增加体内雌激素等，都可以通过改善内分泌对乳房保健有间接作用。
相对于口服保健品，用食物丰胸调经、改善气色，是低风险又颇为有效的方法，如黄豆和葛根内含有大量的植物雌激素，对女性体内的雌激素水平可以起到双向调节作用，是很好的“天然保健品”。
除了葛根之外，每日用醪糟煮鸡蛋加生姜调和营卫也是不错的选择。菊花、玫瑰花茶，柑橘、海带等食物对乳房疼痛的预防、治疗也有一定帮助。
哺乳期那些事儿
怎么防治乳腺炎
在门诊上经常会有哺乳期的妈妈因急性乳腺炎引起高烧从急诊转入乳腺科。轻者服中药 3剂即可退热，重则需要切开排脓，痛苦不堪。
急性乳腺炎多因乳汁排不尽而引起感染，如果积极预防、及早治疗的话大多不会发展到化脓。
如果能够在哺乳前湿热敷（温度控制在 40 ～ 45℃左右）3 ～ 5 分钟，再加上按摩、频繁哺乳，可以帮助排空乳房内的乳汁。
除此外，注意避免让小儿含乳而睡，或每日适量服用蒲公英等中药代茶饮，都可减轻胀痛，减少感染几率。
中医手法排乳和中药外敷对乳腺炎治疗很有帮助，治疗期间不影响哺乳，但方法很有讲究，若掌握不当会导致炎症扩散加重，最好寻求专科医生进行治疗。
产后缺乳怎么办
产后缺乳也是让一些妈妈头疼不已的问题。除非先天发育不良，否则预防产后缺乳最重要的一环就是早期的乳头刺激。一般建议在生产后半小时内开始哺乳，时间和频率取决于新生儿的需要及乳母感到奶涨的情况。
若产后母婴分离无法哺乳，也应行手法挤奶以促进乳汁持续分泌。
穴位按摩
乳汁分泌正常与缺乳的分水岭发生在产后 3 ～ 4 天，所以一开始奶少的妈妈也不要太紧张，可以按揉催乳又通乳的少泽穴。
该穴位于小指末节外侧指甲根处，可用拇指端按揉少泽穴 5 分钟，休息 5分钟，以小指末节皮肤微微发红为度，每天 3 次。
中药与食疗
除了穴位按摩，还可以辨证地配合食补或中药治疗产后缺乳，民间有“穿山甲、王不留，妇人吃了乳长流”的经验，其中穿山甲可以用猪蹄甲代替，通草、蒲公英、仙鹤草等药物对通乳也都有帮助。
如何回乳不痛苦
讲到回乳，最简单的退奶方法就是停止哺乳，不排空乳房，但此过程会有剧烈的胀痛，除了吃止疼片之外还有没有别的办法呢？当然是有的。
回乳方
可用芒硝，在两侧各以 250 克外敷，湿则更换，通过芒硝高渗吸水减少乳房内液体，可以减少腺体分泌，缓解疼痛，同时配合生麦芽或炒麦芽 60 ～ 90 克每日煎水代茶饮，连续 5 ～ 7 日可基本乳退痛消。
我们给患者回奶还常用到中医的一个古方叫“免怀汤”，寓意为让孩子不再黏在妈妈怀中吃奶而得名 ：
当归尾 15 克，赤芍药 15 克，红花（酒浸）15 克，牛膝（酒浸）15 克。无论如何，最好是选择逐渐减少喂奶次数的方法以减轻疼痛。如果效果不满意，还可以在医生的指导下使用溴隐亭等西药治疗。
回乳后乳房下垂怎么办
通常情况下，9 ～ 10 个月后乳汁分泌会自然减少，而断乳后，乳汁分泌停止，乳房里的腺泡逐渐萎缩崩解，导管也萎缩变窄，而纤维组织的增长不足以弥补这些损失，故断奶后乳腺势必会趋于松弛下垂，需要 3 个月至半年方能恢复。
为 了 减 轻 这 种 现 象 也 需 要 尽 早 行动—妊娠期、哺乳期要佩戴合适的乳罩，适时排空乳房、产后适当地锻炼上肢、按摩胸部、坚持合理的饮食结构，这些都是乳房恢复的基石。
更年期防乳腺癌
绝经期妇女随着卵巢功能的减退，乳腺中的导管、小叶结构逐渐萎缩，代之以纤维和脂肪，若是年轻时患有乳腺增生，那么这个时期大多会逐渐好转。
但由于现在很多人饮食中外源性雌激素有所增加，再加上有些人需要服用某些药物，老年女性出现乳房疼痛的现象并不少见。
特别是有些女性因为担心绝经后变老，盲目选用保健品甚至雌激素替代疗法，以保持激素水平，其实这些做法对乳腺的健康是很不利的。
我们应接受“生长壮老已”的自然规律，让身体平稳过渡，不能用人为延长月经周期的方法来“留住青春”，因为高雌激素状态会刺激乳腺异常增生，甚至诱发乳腺癌。绝经是正常的生理过程，除非有严重的更年期反应等情况，否则是不推荐服用激素类物质的。
而且，激素治疗也必须在医生的严格指导下选用，因为医生还要根据患者是否有乳腺疾病，以及是否有乳腺癌家族史等因素，确定是否使用激素治疗。
我国乳腺癌高发年龄段与西方国家不同，并呈现双峰分布，分别集中在绝经前期和绝经后期，约 41 ～ 45 岁和 56 ～ 60岁，无论是绝经前还是绝经后，腹型肥胖都会增加乳腺癌的风险，所以生活方式的调节—饮食、运动、作息、情绪才是乳腺乃至全身健康的制胜关键。(庞广赫 夏仲元)
药物丰胸需谨慎
女性都会关注怎么做能让乳房更健康美观，乳房保健按摩因为其简便易行的特点颇受广大女性朋友的喜爱，下面我们就来介绍一下乳房保健按摩的方法和注意事项。
乳房保健按摩
乳房保健按摩可以加强胸部血液循环，有助于局部的新陈代谢，同时使交感和副交感神经系统活跃。
从中医角度来看，乳房周围有肾经、胃经、肝经、脾经等经络通过，按摩点穴是促进乳房健美的好方法，所以每天临睡前或早晨醒来后不妨仰卧在床按摩乳房。
【操作方法】 双手像乳房自检那样在双乳周围有节奏地自我旋转按摩，直到乳房皮肤微红微热为止。
若因情志不遂引起了胸闷、乳房胀痛，可用掌根缓缓旋转按揉肝经章门穴所在的胁肋部，力度以微痛为度，一圈配合一次深呼吸，49 下可缓解 ；月经期乳房胀痛者在睡前按摩上述穴位，并用双掌根相叠旋转按揉任脉上的膻中穴、关元穴，一圈配合一次深呼吸，每个位置 49 次。
除了乳房保健按摩以外，女性朋友还喜欢选用一些外用或内服的药物来丰胸，在此笔者提醒大家注意以下几点。
【外用 ：丰乳霜与精油】
大城市乳房保养精油按摩很盛行，广告常宣传其可以使皮肤白皙细腻，乳房丰满。
其实，很多丰胸产品都有可能含有激素添加剂，其丰胸效果越明显，隐藏的风险也越大。
而且，雌激素引起的乳房变化只是一时之效，外源性雌激素会影响体内雌激素的分泌，一旦停用，反弹会很严重 ；若长期使用导致雌激素过量，则可能会发生色素沉着、乳腺增生疼痛、乳腺纤维瘤等，月经也会受影响，还会增加乳腺癌的风险。
除了要注意丰胸产品中的成分以外，有乳腺疾病的患者，或使用后乳房明显肿胀者对于精油、丰乳膏推拿也应尽量避免。
【内服 ：乳腺保健食品】
那么，维生素 E 和蜂王浆等受到女性欢迎的保健品是否对乳腺保健有益呢？维生素 E 能促进性激素分泌，蜂王浆内的活性成分能够增加体内雌激素等，都可以通过改善内分泌对乳房保健有间接作用。
相对于口服保健品，用食物丰胸调经、改善气色，是低风险又颇为有效的方法，如黄豆和葛根内含有大量的植物雌激素，对女性体内的雌激素水平可以起到双向调节作用，是很好的“天然保健品”。
除了葛根之外，每日用醪糟煮鸡蛋加生姜调和营卫也是不错的选择。菊花、玫瑰花茶，柑橘、海带等食物对乳房疼痛的预防、治疗也有一定帮助。
哺乳期那些事儿
怎么防治乳腺炎
在门诊上经常会有哺乳期的妈妈因急性乳腺炎引起高烧从急诊转入乳腺科。轻者服中药 3剂即可退热，重则需要切开排脓，痛苦不堪。
急性乳腺炎多因乳汁排不尽而引起感染，如果积极预防、及早治疗的话大多不会发展到化脓。
如果能够在哺乳前湿热敷（温度控制在 40 ～ 45℃左右）3 ～ 5 分钟，再加上按摩、频繁哺乳，可以帮助排空乳房内的乳汁。
除此外，注意避免让小儿含乳而睡，或每日适量服用蒲公英等中药代茶饮，都可减轻胀痛，减少感染几率。
中医手法排乳和中药外敷对乳腺炎治疗很有帮助，治疗期间不影响哺乳，但方法很有讲究，若掌握不当会导致炎症扩散加重，最好寻求专科医生进行治疗。
产后缺乳怎么办
产后缺乳也是让一些妈妈头疼不已的问题。除非先天发育不良，否则预防产后缺乳最重要的一环就是早期的乳头刺激。一般建议在生产后半小时内开始哺乳，时间和频率取决于新生儿的需要及乳母感到奶涨的情况。
若产后母婴分离无法哺乳，也应行手法挤奶以促进乳汁持续分泌。
穴位按摩
乳汁分泌正常与缺乳的分水岭发生在产后 3 ～ 4 天，所以一开始奶少的妈妈也不要太紧张，可以按揉催乳又通乳的少泽穴。
该穴位于小指末节外侧指甲根处，可用拇指端按揉少泽穴 5 分钟，休息 5分钟，以小指末节皮肤微微发红为度，每天 3 次。
中药与食疗
除了穴位按摩，还可以辨证地配合食补或中药治疗产后缺乳，民间有“穿山甲、王不留，妇人吃了乳长流”的经验，其中穿山甲可以用猪蹄甲代替，通草、蒲公英、仙鹤草等药物对通乳也都有帮助。
如何回乳不痛苦
讲到回乳，最简单的退奶方法就是停止哺乳，不排空乳房，但此过程会有剧烈的胀痛，除了吃止疼片之外还有没有别的办法呢？当然是有的。
回乳方
可用芒硝，在两侧各以 250 克外敷，湿则更换，通过芒硝高渗吸水减少乳房内液体，可以减少腺体分泌，缓解疼痛，同时配合生麦芽或炒麦芽 60 ～ 90 克每日煎水代茶饮，连续 5 ～ 7 日可基本乳退痛消。
我们给患者回奶还常用到中医的一个古方叫“免怀汤”，寓意为让孩子不再黏在妈妈怀中吃奶而得名 ：
当归尾 15 克，赤芍药 15 克，红花（酒浸）15 克，牛膝（酒浸）15 克。无论如何，最好是选择逐渐减少喂奶次数的方法以减轻疼痛。如果效果不满意，还可以在医生的指导下使用溴隐亭等西药治疗。
回乳后乳房下垂怎么办
通常情况下，9 ～ 10 个月后乳汁分泌会自然减少，而断乳后，乳汁分泌停止，乳房里的腺泡逐渐萎缩崩解，导管也萎缩变窄，而纤维组织的增长不足以弥补这些损失，故断奶后乳腺势必会趋于松弛下垂，需要 3 个月至半年方能恢复。
为 了 减 轻 这 种 现 象 也 需 要 尽 早 行动—妊娠期、哺乳期要佩戴合适的乳罩，适时排空乳房、产后适当地锻炼上肢、按摩胸部、坚持合理的饮食结构，这些都是乳房恢复的基石。
更年期防乳腺癌
绝经期妇女随着卵巢功能的减退，乳腺中的导管、小叶结构逐渐萎缩，代之以纤维和脂肪，若是年轻时患有乳腺增生，那么这个时期大多会逐渐好转。
但由于现在很多人饮食中外源性雌激素有所增加，再加上有些人需要服用某些药物，老年女性出现乳房疼痛的现象并不少见。
特别是有些女性因为担心绝经后变老，盲目选用保健品甚至雌激素替代疗法，以保持激素水平，其实这些做法对乳腺的健康是很不利的。
我们应接受“生长壮老已”的自然规律，让身体平稳过渡，不能用人为延长月经周期的方法来“留住青春”，因为高雌激素状态会刺激乳腺异常增生，甚至诱发乳腺癌。绝经是正常的生理过程，除非有严重的更年期反应等情况，否则是不推荐服用激素类物质的。
而且，激素治疗也必须在医生的严格指导下选用，因为医生还要根据患者是否有乳腺疾病，以及是否有乳腺癌家族史等因素，确定是否使用激素治疗。
我国乳腺癌高发年龄段与西方国家不同，并呈现双峰分布，分别集中在绝经前期和绝经后期，约 41 ～ 45 岁和 56 ～ 60岁，无论是绝经前还是绝经后，腹型肥胖都会增加乳腺癌的风险，所以生活方式的调节—饮食、运动、作息、情绪才是乳腺乃至全身健康的制胜关键。(庞广赫 夏仲元)
大家好,我是你们的科普达人小V，上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点，这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
奉化水蜜桃小贴士:
小误区
一.6年前左右，我基本不吃桃子，那时候奉化水蜜桃价格是一般桃子的n倍，一直理解不了，不就是一样的桃子吗？
但是老妈喜欢吃桃子，于是给她寄了点，顺便自己尝了一个，后来我自己也喜欢上了奉化水蜜桃，孩子也特别喜欢吃它们，每年都会挂念它们。
二.前年一位北京小伙伴说为什么桃子个头这么小，一定是重量不足的。我百思不得其”姐”。
于是查了顺丰的原始数据，发现其实反而超了一斤左右。这我才想起来，在北京的时候发现，北京的桃子都是很大的，8两一斤的真的很正常，而奉化水蜜桃个头相对娇小，老品种的奉化水蜜桃基本只有2两半到3两半之间，只有北京的三分之一到四分之一的大小，现在虽然改良过了，但是平均重量，基本也在3两半到4两之间，这也是为什么，很多淘宝卖家主打12只4斤的原因，因为平均重量就是这么大。
三.有的小伙伴收到后会说，为什么这么小，这么难看？有的桃子怎么是淡黄色或者青色的？
奉化水蜜桃整体个头就小，也不好看，以前的奉化水蜜桃上面还都是麻点，青青的颜色。现在经过改良后外观都有所改观，但是因为水蜜桃有多个品种，所以外观还是有差异的。
我们主要卖的是湖景玉露和白丽
湖景玉露特点：
外观粉红色，就是照片二的这种，香气比较浓，水分足，甜度因为湖景玉露成熟期的时候温度稍微低一点，所以甜度稍微低点，今年糖度基本12到13左右，但是它们是奉化水蜜桃前半场的主打品种。。。
成熟的桃子，其实颜色还会由红中带青变成红中带黄，这时候桃子基本变软了，水分足。
白丽水蜜桃见图三特点:
这是第二个主打水蜜桃，现在的品种就是它们。特点，肉质细腻，甜度高点，水分足。它们是老奉化水蜜桃作为母本的，所以外表大部分青色，让人感觉没成熟的样子。
四.有的一般伙伴说为什么有的水蜜桃吃起来口感不甜或者口感不好？
这个原因很多。1.市场上李鬼很多，即使宁波市场也到处是外地桃子。所以正宗的奉化水蜜桃不是很容易吃到的。
2.即使是奉化产的水蜜桃也不是个个都好吃的。
水蜜桃田里，山上种植的，整体山上的甜，
每棵树上阳光照到多点的更甜，如树顶和朝阳的这些桃子更甜。
成熟度高的更甜。
因为运输原因，所以快递的都是6成到7成熟的，否则路上要么容易被野蛮的快递颠簸，扔摔很容易损伤，变质。很多小伙伴甚至会误解发软的桃子收到，认为这是坏桃子。
另外说一下快递，顺丰快递费巨贵，到北京基本7公斤得110元的快递包装成本其中十元是顺丰快递的标准箱子的钱。海南估计要130到140元左右。
一般的快递，损伤率肯定高一点，桃子即使是7成熟左右的，在扔摔，颠簸，挤压的考验之外，还有闷在纸箱内的桃子，由于散发的香气中含有催熟的成分，所以很容易催熟桃子，有的时候前一天青青的，第二天早上可能就会发现有几个烂了，何况一般快递外省的一般要在路上多一个晚上，这个很致命。不是都会有这风险，而是桃子发生腐烂的风险概率会高很多倍。
有的小伙伴说你根本在给自己找理由，包装好点就可以。
对于这部分小伙伴，建议自己去淘宝了解一下，应该能在其他淘宝店的评价上找出端倪的。
正因为一般快递风险高很多，所以淘宝卖家首选顺丰，即使成本高昂，所以一般快递损耗率会相对高很多，如果刚好您收到的损坏了，好好的沟通，大家相互尊重，我们会酌情返款（主要针对试吃装），说白了几元钱而已，何苦？（以后要是试吃会说明情况，针对吹毛求疵的少数几位，建议千万不要下单）我只是想把这个味道传递给更多人而已，有损失的我承担。
但是在我亏本的情况下，
好心当成驴肝肺，
为了几元钱不尊重我们的，
我们非常不欢迎，
不管你是谁！！！！！
另外，水蜜桃成熟度低了，风险是相对难成熟，可能在没成熟变软之前，水分被流动空气带走，就会象橡皮一样，口感较差，这种情况，建议收到桃子摊开，但是稍微包点纸或者放纸箱里，这样水分流失慢一点，或者放冰箱的密封容器内，这样不会失水保存期长。
建议小伙伴多关注口感，少关注外观。
这几天基本是奉化水蜜桃甜度最好的时候，可能也就一周左右时间了，水蜜桃季基本结束了。有需求的可以下单，水蜜桃价格其实也一直在涨价，随行就市了。
不要以为我能赚多少，一多半是顺丰的，价格一直在涨，12只和24只装的一直给大家的是大规格，甚至可以说是特大规格的，一直没给大家解释，一直以为不需要解释的，因为一直都这么坚持，但是这次还是在这里说一下，开始说的5斤10斤装的，一般给大家的基本是5斤半到6斤以上的，或者11到12斤以上的。可能有的小伙伴认为这个没什么，只是半斤一斤而已。
但是您到某宝搜搜就明白了，很多说的5斤其实是5斤毛重，4斤净重，或者有5斤的，一般也是平均值5斤。
其实就是这个重量相差，一，规格大了，桃子价格自然高，一般会贵百分之几十的价格，其次重量多一斤两斤，我就损失几十元，加上快递费是按重量的又会多出十几元，这样叠加，您还会认为我们的桃子贵吗？
小误区
一.6年前左右，我基本不吃桃子，那时候奉化水蜜桃价格是一般桃子的n倍，一直理解不了，不就是一样的桃子吗？
但是老妈喜欢吃桃子，于是给她寄了点，顺便自己尝了一个，后来我自己也喜欢上了奉化水蜜桃，孩子也特别喜欢吃它们，每年都会挂念它们。
二.前年一位北京小伙伴说为什么桃子个头这么小，一定是重量不足的。我百思不得其”姐”。
于是查了顺丰的原始数据，发现其实反而超了一斤左右。这我才想起来，在北京的时候发现，北京的桃子都是很大的，8两一斤的真的很正常，而奉化水蜜桃个头相对娇小，老品种的奉化水蜜桃基本只有2两半到3两半之间，只有北京的三分之一到四分之一的大小，现在虽然改良过了，但是平均重量，基本也在3两半到4两之间，这也是为什么，很多淘宝卖家主打12只4斤的原因，因为平均重量就是这么大。
三.有的小伙伴收到后会说，为什么这么小，这么难看？有的桃子怎么是淡黄色或者青色的？
奉化水蜜桃整体个头就小，也不好看，以前的奉化水蜜桃上面还都是麻点，青青的颜色。现在经过改良后外观都有所改观，但是因为水蜜桃有多个品种，所以外观还是有差异的。
我们主要卖的是湖景玉露和白丽
湖景玉露特点：
外观粉红色，就是照片二的这种，香气比较浓，水分足，甜度因为湖景玉露成熟期的时候温度稍微低一点，所以甜度稍微低点，今年糖度基本12到13左右，但是它们是奉化水蜜桃前半场的主打品种。。。
成熟的桃子，其实颜色还会由红中带青变成红中带黄，这时候桃子基本变软了，水分足。
白丽水蜜桃见图三特点:
这是第二个主打水蜜桃，现在的品种就是它们。特点，肉质细腻，甜度高点，水分足。它们是老奉化水蜜桃作为母本的，所以外表大部分青色，让人感觉没成熟的样子。
四.有的一般伙伴说为什么有的水蜜桃吃起来口感不甜或者口感不好？
这个原因很多。1.市场上李鬼很多，即使宁波市场也到处是外地桃子。所以正宗的奉化水蜜桃不是很容易吃到的。
2.即使是奉化产的水蜜桃也不是个个都好吃的。
水蜜桃田里，山上种植的，整体山上的甜，
每棵树上阳光照到多点的更甜，如树顶和朝阳的这些桃子更甜。
成熟度高的更甜。
因为运输原因，所以快递的都是6成到7成熟的，否则路上要么容易被野蛮的快递颠簸，扔摔很容易损伤，变质。很多小伙伴甚至会误解发软的桃子收到，认为这是坏桃子。
另外说一下快递，顺丰快递费巨贵，到北京基本7公斤得110元的快递包装成本其中十元是顺丰快递的标准箱子的钱。海南估计要130到140元左右。
一般的快递，损伤率肯定高一点，桃子即使是7成熟左右的，在扔摔，颠簸，挤压的考验之外，还有闷在纸箱内的桃子，由于散发的香气中含有催熟的成分，所以很容易催熟桃子，有的时候前一天青青的，第二天早上可能就会发现有几个烂了，何况一般快递外省的一般要在路上多一个晚上，这个很致命。不是都会有这风险，而是桃子发生腐烂的风险概率会高很多倍。
有的小伙伴说你根本在给自己找理由，包装好点就可以。
对于这部分小伙伴，建议自己去淘宝了解一下，应该能在其他淘宝店的评价上找出端倪的。
正因为一般快递风险高很多，所以淘宝卖家首选顺丰，即使成本高昂，所以一般快递损耗率会相对高很多，如果刚好您收到的损坏了，好好的沟通，大家相互尊重，我们会酌情返款（主要针对试吃装），说白了几元钱而已，何苦？（以后要是试吃会说明情况，针对吹毛求疵的少数几位，建议千万不要下单）我只是想把这个味道传递给更多人而已，有损失的我承担。
但是在我亏本的情况下，
好心当成驴肝肺，
为了几元钱不尊重我们的，
我们非常不欢迎，
不管你是谁！！！！！
另外，水蜜桃成熟度低了，风险是相对难成熟，可能在没成熟变软之前，水分被流动空气带走，就会象橡皮一样，口感较差，这种情况，建议收到桃子摊开，但是稍微包点纸或者放纸箱里，这样水分流失慢一点，或者放冰箱的密封容器内，这样不会失水保存期长。
建议小伙伴多关注口感，少关注外观。
这几天基本是奉化水蜜桃甜度最好的时候，可能也就一周左右时间了，水蜜桃季基本结束了。有需求的可以下单，水蜜桃价格其实也一直在涨价，随行就市了。
不要以为我能赚多少，一多半是顺丰的，价格一直在涨，12只和24只装的一直给大家的是大规格，甚至可以说是特大规格的，一直没给大家解释，一直以为不需要解释的，因为一直都这么坚持，但是这次还是在这里说一下，开始说的5斤10斤装的，一般给大家的基本是5斤半到6斤以上的，或者11到12斤以上的。可能有的小伙伴认为这个没什么，只是半斤一斤而已。
但是您到某宝搜搜就明白了，很多说的5斤其实是5斤毛重，4斤净重，或者有5斤的，一般也是平均值5斤。
其实就是这个重量相差，一，规格大了，桃子价格自然高，一般会贵百分之几十的价格，其次重量多一斤两斤，我就损失几十元，加上快递费是按重量的又会多出十几元，这样叠加，您还会认为我们的桃子贵吗？
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