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含胸驼背、弯侧柱脊普遍年轻化
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【方案参考 | 微生物蛋白纯化实验室搭建模版】
一级学科：生物学
二级学科：生物化学、微生物学
简述：方案包含重组载体构建、蛋白纯化、蛋白性质分析等3大部分3个流程，涉及21种设备。
核心设备：高压破碎仪、蛋白纯化仪、高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计、高效液相色谱
关键词：重组载体构建、蛋白纯化、亲和层析、疏水层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、生理生化性质鉴定。
基本概念：重组载体构建、蛋白纯化、亲和层析、疏水层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、蛋白性质分析。
实验流程：
蛋白纯化主要包括三个步骤：1）重组载体的构建；2）蛋白的上柱纯化；3）蛋白性质分析。
1、重组载体的构建
蛋白纯化主要分为异源表达纯化和野生菌纯化。其中异源表达纯化在蛋白上柱纯化之前需要构建目的基因的重组载体，并且在载体构建过程中给目的基因添加特殊的标签，如His-Tag、GST、Strep等，最终通过相应的亲和层析柱获得目的蛋白.此方法为蛋白纯化最常用的方法。
而野生菌纯化则是通过离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析（凝胶过滤）等方法原理，从野生菌中直接获得某种蛋白的蛋白纯化方法。
其中重组载体的构建主要由分为三个步骤：1）目的基因片段的获得；2）酶切及切胶回收；3）酶连、转化及保存等
1.1目的基因片段的获得（对应编号1-1）
选用合适的质粒作为载体，并选择合适的双酶切位点。
以相应菌株的基因组为模板，设计相应引物，利用PCR仪对目的基因进行扩增，获得大量的目的基因片段。
1.2酶切及切胶回收（对应编号1-2）
将PCR获得的目的基因片段和提取的质粒同时进行双酶切处理，该过程需要在恒温水浴槽中37℃中酶切40 min。
对酶切之后的反应液利用水平电泳仪进行TAE琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下切下目的片段及酶切后的载体片段，用DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收，该回收过程需要多次用到小型高速离心机。
1.3酶连、转化及保存（对应编号1-3、1-4）
用T4 DNA Ligase对切胶回收后的目的片段和载体质粒进行酶连实验，该过程需要在恒温水浴槽中25℃中酶连30 min左右，最终将酶连产物通过转化转入克隆宿主。
转化的方法有两种，第一种方法是通过电转化法，直接通过电转仪将重组后的质粒转入克隆宿主，省时高效；另一种方法是将连接液加入到感受态细胞中，冰浴30 min，之后37℃水浴5 min，冰上放置3 min，之后超净台中加入500 μL LB培养基，37℃振荡培养箱振荡培养约1 h。
将上述培养液在超净工作台进行平板涂布，过夜培养观察平板菌落生长情况。
通过PCR验证与测序挑选正确的转化子，并将正确的转化子转入到表达宿主中，经PCR验证后将含有重组质粒的表达宿主甘油处理，并保存在超低温冰箱的-80℃环境中。
2、蛋白的上柱纯化
蛋白的上柱纯化主要分为四个步骤组成：1）目的细胞的培养；2）目的细胞的破碎及离心；3）目的蛋白上柱纯化及浓缩脱盐等。
2.1 目的细胞的培养（对应编号2-1）
对于异源表达纯化来说，需对上述含有重组质粒的表达宿主进行诱导表达。
一般方法如下（假设表达宿主为BL21（DE3），载体为pET28b(+)）：将测序成功的含有重组质粒的表达宿主在超净工作台接种至LB培养基，在大容量恒温振荡器中37℃、170 rpm培养至OD值达到0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG（终浓度一般为0.5 mM），降低温度和转速至30℃、130 rpm，过夜诱导后利用大容量高速冷冻离心机收菌，并用pH 7.0的50 mM磷酸钠清洗两遍，-20℃保存细胞。
而对于野生菌纯化来说，只需在该菌株最适生长条件之下培养获得大量菌体，以备下一步试验所需。
该过程中培养基以及以下步骤所需的缓冲液均需要pH计来调剂pH。如果所需目的细胞为厌氧细胞，需用厌氧手套箱进行培养基的配制。
2.2 目的细胞的破碎及离心（对应编号2-2、2-3）
将目的细胞用缓冲液重悬，并用高压细胞破碎仪破碎目的细胞，如果是革兰氏染色阳性的细胞，需在菌悬液中添加溶菌酶，并在37℃下恒温水浴30 min。
细胞破碎液用高速冷冻离心机在35000 ×g、4℃下离心30 min，将上清用0.22 μm滤头过滤，最终获得上清粗酶液。
对于膜蛋白组分，需用超速离心机进行离心。
2.3 目的蛋白上柱纯化（对应编号2-4、2-5）
对于异源表达纯化来说，将上述步骤制备的粗酶液通过蠕动泵上样到以亲和层析为主的蛋白纯化柱上（此处以常用的His-Tag和Ni柱为例）。
将上样完成的Ni柱利用蛋白纯化仪进行咪唑梯度蛋白洗脱，并将每个梯度的样品分别收取，并利用浓缩管和高速冷冻离心机对蛋白进行浓缩脱盐，用于目的蛋白的验证和表征。
相比异源表达纯化，野生菌纯化要复杂得多。首先需知道所要纯化蛋白的基本性质，比如所催化的基础反应。
利用此反应，依据不同的纯化原理来进一步捕获和纯化蛋白，该过程需要蛋白纯化仪的支持。
如首先通过蠕动泵上样离子交换层析柱（通常用Q柱或DEAE柱），该层析柱通过逐步提高盐浓度洗脱蛋白，依据目的蛋白所催化的基础反应捕获蛋白，该过程通常需要用到电脑实时监测的双光束紫外可见分光光度计。
当监测到目的蛋白所在梯度后，对该梯度进行蛋白浓缩，并将缓冲液换成疏水层析柱（一般为苯基柱）的缓冲液。
将上述样品通过蠕动泵上样苯基柱，该层析柱需要逐步降低盐浓度来洗脱蛋白，依据目的蛋白所催化的基础反应进一步蛋白，并将目的蛋白梯度浓缩脱盐。
再将上一步样品利用尺寸排阻层析柱（分子筛）进一步纯化蛋白样品，最终获得较纯的蛋白样品，用于蛋白生理生化性质的分析，还可通过分子筛测定蛋白的分子量，并预测蛋白亚基的聚合形式。
3、蛋白性质分析
对于蛋白的生理生化性质的测定，主要包括以下几个方面：1）蛋白浓度测定及SDS-PAGE电泳；2）催化性质及其产物测定；3）辅基测定；4）蛋白结构解析等。
3.1 蛋白浓度测定及SDS-PAGE电泳（对应编号3-1）
对于蛋白浓度的测定，一般以牛血清白蛋白为标准品，用Bradford法进行测定，该测定须使用紫外可见分光光度计。
SDS-PAGE电泳首先对蛋白样品进行处理，选择合适浓度的蛋白样品，加入蛋白loading，100℃金属浴10 min，经小型高速离心机离心后，在垂直电泳槽中点样，最终完成蛋白电泳。
3.2 催化性质及其产物测定（对应编号3-2、3-4）
对于目的蛋白催化性质的测定，一般可使用电脑实时监测的双光束紫外可见分光光度计来完成，通过监测底物的消耗或产物的生成监测反应进行，并可通过计算酶活曲线的斜率计算比酶活。
有的反应因底物产物较为相似，无法用紫外可见分光光度计分开，这时需要高效液相色谱（HPLC）来监测反应的进行，一般通过监测单位时间内产物的生成来计算比酶活。
3.3 辅基测定（对应编号3-3）
对于蛋白辅基的测定，测定方法多种多样。
如Fe含量的测定，通常使用 Ferene法，该方法需用到紫外可见分光光度计和金属浴。
对于蛋白中其他离子的鉴定与定量如Zn、Mo、W和S等，其最便捷高效的方法就是使用原子吸收光谱进行测定。
而对于其他辅基如FAD、FMN等，其最简便的鉴别定量方法是利用HPLC进行监测。
3.3 蛋白结构解析（对应编号3-5、3-6）
目前对于蛋白质二级结构的研究，其主要手段之一是利用圆二色光谱进行鉴定，该方法广泛应用于蛋白质的构象研究中。
而对于蛋白质三级结构的解析，主要的方法包括X-射线衍射法、核磁共振和冷冻电镜。
其中X-射线衍射法需要先对蛋白进行结晶，然后利用X-射线衍射仪进行结构分析，因此适用于较小分子蛋白质的结构解析，因为大分子蛋白很难结晶，该方法同样很难捕捉蛋白质动态变化过程；
核磁共振依据强磁场中原子和对射频辐射的吸收作用，需要用到核磁共振波谱仪进行研究，该方法可以捕捉蛋白质分子动力学，但是仅适用于小分子蛋白；
冷冻电镜是近年来兴起的蛋白质结构测定方法，难以结晶的膜蛋白以及生物大分子复合体可用此方法进行解析。#木木西里# #实验方案# #微生物蛋白#
一级学科：生物学
二级学科：生物化学、微生物学
简述：方案包含重组载体构建、蛋白纯化、蛋白性质分析等3大部分3个流程，涉及21种设备。
核心设备：高压破碎仪、蛋白纯化仪、高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计、高效液相色谱
关键词：重组载体构建、蛋白纯化、亲和层析、疏水层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、生理生化性质鉴定。
基本概念：重组载体构建、蛋白纯化、亲和层析、疏水层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、蛋白性质分析。
实验流程：
蛋白纯化主要包括三个步骤：1）重组载体的构建；2）蛋白的上柱纯化；3）蛋白性质分析。
1、重组载体的构建
蛋白纯化主要分为异源表达纯化和野生菌纯化。其中异源表达纯化在蛋白上柱纯化之前需要构建目的基因的重组载体，并且在载体构建过程中给目的基因添加特殊的标签，如His-Tag、GST、Strep等，最终通过相应的亲和层析柱获得目的蛋白.此方法为蛋白纯化最常用的方法。
而野生菌纯化则是通过离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析（凝胶过滤）等方法原理，从野生菌中直接获得某种蛋白的蛋白纯化方法。
其中重组载体的构建主要由分为三个步骤：1）目的基因片段的获得；2）酶切及切胶回收；3）酶连、转化及保存等
1.1目的基因片段的获得（对应编号1-1）
选用合适的质粒作为载体，并选择合适的双酶切位点。
以相应菌株的基因组为模板，设计相应引物，利用PCR仪对目的基因进行扩增，获得大量的目的基因片段。
1.2酶切及切胶回收（对应编号1-2）
将PCR获得的目的基因片段和提取的质粒同时进行双酶切处理，该过程需要在恒温水浴槽中37℃中酶切40 min。
对酶切之后的反应液利用水平电泳仪进行TAE琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下切下目的片段及酶切后的载体片段，用DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收，该回收过程需要多次用到小型高速离心机。
1.3酶连、转化及保存（对应编号1-3、1-4）
用T4 DNA Ligase对切胶回收后的目的片段和载体质粒进行酶连实验，该过程需要在恒温水浴槽中25℃中酶连30 min左右，最终将酶连产物通过转化转入克隆宿主。
转化的方法有两种，第一种方法是通过电转化法，直接通过电转仪将重组后的质粒转入克隆宿主，省时高效；另一种方法是将连接液加入到感受态细胞中，冰浴30 min，之后37℃水浴5 min，冰上放置3 min，之后超净台中加入500 μL LB培养基，37℃振荡培养箱振荡培养约1 h。
将上述培养液在超净工作台进行平板涂布，过夜培养观察平板菌落生长情况。
通过PCR验证与测序挑选正确的转化子，并将正确的转化子转入到表达宿主中，经PCR验证后将含有重组质粒的表达宿主甘油处理，并保存在超低温冰箱的-80℃环境中。
2、蛋白的上柱纯化
蛋白的上柱纯化主要分为四个步骤组成：1）目的细胞的培养；2）目的细胞的破碎及离心；3）目的蛋白上柱纯化及浓缩脱盐等。
2.1 目的细胞的培养（对应编号2-1）
对于异源表达纯化来说，需对上述含有重组质粒的表达宿主进行诱导表达。
一般方法如下（假设表达宿主为BL21（DE3），载体为pET28b(+)）：将测序成功的含有重组质粒的表达宿主在超净工作台接种至LB培养基，在大容量恒温振荡器中37℃、170 rpm培养至OD值达到0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG（终浓度一般为0.5 mM），降低温度和转速至30℃、130 rpm，过夜诱导后利用大容量高速冷冻离心机收菌，并用pH 7.0的50 mM磷酸钠清洗两遍，-20℃保存细胞。
而对于野生菌纯化来说，只需在该菌株最适生长条件之下培养获得大量菌体，以备下一步试验所需。
该过程中培养基以及以下步骤所需的缓冲液均需要pH计来调剂pH。如果所需目的细胞为厌氧细胞，需用厌氧手套箱进行培养基的配制。
2.2 目的细胞的破碎及离心（对应编号2-2、2-3）
将目的细胞用缓冲液重悬，并用高压细胞破碎仪破碎目的细胞，如果是革兰氏染色阳性的细胞，需在菌悬液中添加溶菌酶，并在37℃下恒温水浴30 min。
细胞破碎液用高速冷冻离心机在35000 ×g、4℃下离心30 min，将上清用0.22 μm滤头过滤，最终获得上清粗酶液。
对于膜蛋白组分，需用超速离心机进行离心。
2.3 目的蛋白上柱纯化（对应编号2-4、2-5）
对于异源表达纯化来说，将上述步骤制备的粗酶液通过蠕动泵上样到以亲和层析为主的蛋白纯化柱上（此处以常用的His-Tag和Ni柱为例）。
将上样完成的Ni柱利用蛋白纯化仪进行咪唑梯度蛋白洗脱，并将每个梯度的样品分别收取，并利用浓缩管和高速冷冻离心机对蛋白进行浓缩脱盐，用于目的蛋白的验证和表征。
相比异源表达纯化，野生菌纯化要复杂得多。首先需知道所要纯化蛋白的基本性质，比如所催化的基础反应。
利用此反应，依据不同的纯化原理来进一步捕获和纯化蛋白，该过程需要蛋白纯化仪的支持。
如首先通过蠕动泵上样离子交换层析柱（通常用Q柱或DEAE柱），该层析柱通过逐步提高盐浓度洗脱蛋白，依据目的蛋白所催化的基础反应捕获蛋白，该过程通常需要用到电脑实时监测的双光束紫外可见分光光度计。
当监测到目的蛋白所在梯度后，对该梯度进行蛋白浓缩，并将缓冲液换成疏水层析柱（一般为苯基柱）的缓冲液。
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3、蛋白性质分析
对于蛋白的生理生化性质的测定，主要包括以下几个方面：1）蛋白浓度测定及SDS-PAGE电泳；2）催化性质及其产物测定；3）辅基测定；4）蛋白结构解析等。
3.1 蛋白浓度测定及SDS-PAGE电泳（对应编号3-1）
对于蛋白浓度的测定，一般以牛血清白蛋白为标准品，用Bradford法进行测定，该测定须使用紫外可见分光光度计。
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3.2 催化性质及其产物测定（对应编号3-2、3-4）
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有的反应因底物产物较为相似，无法用紫外可见分光光度计分开，这时需要高效液相色谱（HPLC）来监测反应的进行，一般通过监测单位时间内产物的生成来计算比酶活。
3.3 辅基测定（对应编号3-3）
对于蛋白辅基的测定，测定方法多种多样。
如Fe含量的测定，通常使用 Ferene法，该方法需用到紫外可见分光光度计和金属浴。
对于蛋白中其他离子的鉴定与定量如Zn、Mo、W和S等，其最便捷高效的方法就是使用原子吸收光谱进行测定。
而对于其他辅基如FAD、FMN等，其最简便的鉴别定量方法是利用HPLC进行监测。
3.3 蛋白结构解析（对应编号3-5、3-6）
目前对于蛋白质二级结构的研究，其主要手段之一是利用圆二色光谱进行鉴定，该方法广泛应用于蛋白质的构象研究中。
而对于蛋白质三级结构的解析，主要的方法包括X-射线衍射法、核磁共振和冷冻电镜。
其中X-射线衍射法需要先对蛋白进行结晶，然后利用X-射线衍射仪进行结构分析，因此适用于较小分子蛋白质的结构解析，因为大分子蛋白很难结晶，该方法同样很难捕捉蛋白质动态变化过程；
核磁共振依据强磁场中原子和对射频辐射的吸收作用，需要用到核磁共振波谱仪进行研究，该方法可以捕捉蛋白质分子动力学，但是仅适用于小分子蛋白；
冷冻电镜是近年来兴起的蛋白质结构测定方法，难以结晶的膜蛋白以及生物大分子复合体可用此方法进行解析。#木木西里# #实验方案# #微生物蛋白#
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