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MiR-29c-3p和MiR-223-3p通过靶向ANGPTL4调控口腔鳞状细胞癌的增殖和耐药性
背景：本研究旨在确定血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）中的表达和功能，并探究miR-29C-3p和miR-223-3p是否可以通过靶向ANGPTL4调控OSCC的增殖和顺铂耐药性。
方法：首先在生物信息学数据库中预测肿瘤中ANGPTL4和microRNAs（miRNAs）的表达，随后通过Western blot和qPCR检测组织和细胞中ANGPTL4和miRNA的蛋白质、mRNA表达水平。通过平板克隆形成、CCK-8实验和IC50确定细胞的增殖和药物敏感性，并使用双荧光素酶报告实验来确定miRNA对ANGPTL4的调控。
结果：ANGPTL4在OSCC组织中较正常组织表达高。敲除ANGPTL4后，OSCC细胞增殖减少，对顺铂的敏感性增加。双荧光素酶报告实验显示，当过表达miR-29c-3p和miR-223-3p后，野生型（wild-type, WT）组的荧光强度减少，而突变型（mutant, MUT）组的荧光强度几乎没有变化。上述结果证明了miRNA的过表达降低了ANGPTL4的蛋白水平，从而影响OSCC细胞增殖和耐药性。
结论：miR-29c-3p和miR-223-3p可以通过靶向ANGPTL4来调控OSCC的细胞增殖和顺铂耐药性。
关键词：口腔鳞状细胞癌（OSCC）；微小RNA（microRNA, miRNA）；血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）；增殖；顺铂耐药性。
·前言
口腔癌（Oral cancer）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全球所有恶性肿瘤的1%～2%[1]。因为口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinom, OSCC）易于转移且预后不良，5年总生存率仅为55%[2]。顺铂（Cisplatin）是OSCC术后化疗的一线药物[3]，但OSCC对顺铂化疗的耐药性日益严重[4]。如何有效提高术后化疗的药物敏感性，是OSCC研究中的一个热点和难题。
近期研究表明血管生成样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）可能参与OSCC的发生，并与OSCC的转移相关[5]，同时ANGPTL4也可能是舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma ，TSCC）的重要标志物以及防止TSCC发展和转移的重要治疗靶点[6]。
本课题组前期研究表明，ANGPTL4的下调可以抑制TSCC的迁移和增殖，且ANGPTL4的高表达与TSCC的T分期、淋巴结转移、血管生成和较差的总生存期相关[7]。ANGPTL4基因位于19p131染色体上，包含7个外显子和6个内含子。目前认为，ANGPTL4家族的主要功能是参与物质和能量代谢的调节，但近期许多研究已证实，ANGPTL4在肿瘤进展中也起着重要的调控作用。此外，仍有研究表明ANGPTL4在肝癌和其他癌症中发挥抑癌作用[8]。ANGPTL4可能作为抑癌基因和致癌基因发挥双重功能，但其调节机制仍不清楚。因此，ANGPTL4在OSCC中的作用值得进一步探索。
微小RNA（MicroRNAs, miRNAs）是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们参与调节转录后基因表达。许多研究已经证明，miRNA的异常表达可以参与头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous carcinoma, HNSC）及其他癌症的发生、发展[9]。miRNA可以调节目标基因的表达水平，诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译。在本研究中，探索了ANGPTL4在OSCC中的表达水平及其变化的影响，验证miRNA对ANGPTL4的靶向调控，并确定miRNA对ANGPTL4的靶向调控是否对OSCC的增殖和耐药性存在影响。本研究将对OSCC的诊断、治疗以及预后预测提供一定的参考作用。按照MDAR报告清单呈现以下文章。（可在https://t.cn/A6YN3H95获取）
·方法
组织收集
本研究符合赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki, 2013年修订版）。该研究已得到中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准（No. SYSEC-KY-KS-2021-028）。从中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科获取了36对来自口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者的肿瘤组织（tumor tissues , T）和癌旁组织（paracancerous tissues, P）。所有患者均为原发OSCC，未接受过术前放疗或化疗。所有样本均存储在-80℃下备用。所有患者均已签署知情同意书。使用了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库来分析头颈鳞状细胞癌（HNSC）和正常组织中ANGPTL4的表达。
细胞培养和处理
购买了来自中国科学院（上海，中国）的HOK、SCC9、UM1、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞系，并使用上述细胞开展实验。所有细胞系均培养于含10％胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，美国）和1％青霉素-链霉素溶液（Thermo Fisher，美国）的DMEM（Thermo Fisher，美国）或DMEM-F12（Thermo Fisher，美国）所配完全培养基，温度37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中。其中HOK、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞培养使用DMEM，SCC9和UM1细胞培养使用F12/DMEM。
RNA提取和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
总RNA使用TRIzol试剂（TaKaRa，日本）提取，按照制造商说明，使用ABI 9700实时PCR仪（ABI，美国）反转录为cDNA。MicroRNA反转录引物按照茎环法[10]设计。1 µL的cDNA与TB Green® Premix Ex Taq™ II (#RR820B, TaKaRa, Japan）按照制造商的说明，在20 µL反应体积下混合。在Light Cycler 480 II实时PCR系统（Roche，瑞士）中测定mRNA的相对表达，使用统计软件进行统计分析。反应条件如下：94℃ 2 min，94℃ 20秒，58℃ 20秒，72℃ 20秒，共40循环，所有反应均重复3次。根据GAPDH和U6的表达进行标准化后，使用2−ΔΔCt方法计算ANGPTL4和microRNA的相对表达水平。如表S1所示，所有PCR引物均从IGEBIO（广州，中国）购买。
Western blot检测
为提取蛋白，将细胞用预冷PBS洗涤2次，刮取收集细胞，然后在含有1%蛋白酶抑制剂（#CW2200S，CWBIO，中国）的裂解缓冲液（#01408，Beyotime，中国）中裂解。离心后，收集上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒（#CW0014S，CWBIO，中国）确定蛋白浓度。稀释并混合上样缓冲液（#CW0027S，CWBIO，中国），并在95℃加热5 min使蛋白变性。按照Beyotime聚丙烯酰胺凝胶试剂盒的说明准备SDS-PAGE凝胶。电泳后（90 V，1.3 h），将蛋白转移到PVDF膜（#P0021S，Beyotime，中国）（250 mA，70 min）。将PVDF膜在含有5％脱脂牛奶和0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中孵育1 h，以封闭蛋白。将一抗ANGPTL4 (#18374-1-AP, Proteintech, USA）和GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, USA）在含有0.1％ Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白抗体稀释液中溶解，稀释比例为1:1000，然后在4℃摇床中孵育16 h（过夜孵育）。将膜在含有0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中洗涤。然后在含有0.1％Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白中，以1:1,000的稀释比例孵育二抗，包括山羊抗小鼠IgG-HRP (#sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, USA）和山羊抗兔IgG-HRP (#sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, USA)1 h。根据标准流程进行显色，拍照和凝胶图像分析。
更多方法请点击微信链接查看！
MiR-29c-3p和MiR-223-3p通过靶向ANGPTL4调控口腔鳞状细胞癌的增殖和耐药性
背景：本研究旨在确定血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）中的表达和功能，并探究miR-29C-3p和miR-223-3p是否可以通过靶向ANGPTL4调控OSCC的增殖和顺铂耐药性。
方法：首先在生物信息学数据库中预测肿瘤中ANGPTL4和microRNAs（miRNAs）的表达，随后通过Western blot和qPCR检测组织和细胞中ANGPTL4和miRNA的蛋白质、mRNA表达水平。通过平板克隆形成、CCK-8实验和IC50确定细胞的增殖和药物敏感性，并使用双荧光素酶报告实验来确定miRNA对ANGPTL4的调控。
结果：ANGPTL4在OSCC组织中较正常组织表达高。敲除ANGPTL4后，OSCC细胞增殖减少，对顺铂的敏感性增加。双荧光素酶报告实验显示，当过表达miR-29c-3p和miR-223-3p后，野生型（wild-type, WT）组的荧光强度减少，而突变型（mutant, MUT）组的荧光强度几乎没有变化。上述结果证明了miRNA的过表达降低了ANGPTL4的蛋白水平，从而影响OSCC细胞增殖和耐药性。
结论：miR-29c-3p和miR-223-3p可以通过靶向ANGPTL4来调控OSCC的细胞增殖和顺铂耐药性。
关键词：口腔鳞状细胞癌（OSCC）；微小RNA（microRNA, miRNA）；血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）；增殖；顺铂耐药性。
·前言
口腔癌（Oral cancer）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，占全球所有恶性肿瘤的1%～2%[1]。因为口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinom, OSCC）易于转移且预后不良，5年总生存率仅为55%[2]。顺铂（Cisplatin）是OSCC术后化疗的一线药物[3]，但OSCC对顺铂化疗的耐药性日益严重[4]。如何有效提高术后化疗的药物敏感性，是OSCC研究中的一个热点和难题。
近期研究表明血管生成样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）可能参与OSCC的发生，并与OSCC的转移相关[5]，同时ANGPTL4也可能是舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma ，TSCC）的重要标志物以及防止TSCC发展和转移的重要治疗靶点[6]。
本课题组前期研究表明，ANGPTL4的下调可以抑制TSCC的迁移和增殖，且ANGPTL4的高表达与TSCC的T分期、淋巴结转移、血管生成和较差的总生存期相关[7]。ANGPTL4基因位于19p131染色体上，包含7个外显子和6个内含子。目前认为，ANGPTL4家族的主要功能是参与物质和能量代谢的调节，但近期许多研究已证实，ANGPTL4在肿瘤进展中也起着重要的调控作用。此外，仍有研究表明ANGPTL4在肝癌和其他癌症中发挥抑癌作用[8]。ANGPTL4可能作为抑癌基因和致癌基因发挥双重功能，但其调节机制仍不清楚。因此，ANGPTL4在OSCC中的作用值得进一步探索。
微小RNA（MicroRNAs, miRNAs）是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们参与调节转录后基因表达。许多研究已经证明，miRNA的异常表达可以参与头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous carcinoma, HNSC）及其他癌症的发生、发展[9]。miRNA可以调节目标基因的表达水平，诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译。在本研究中，探索了ANGPTL4在OSCC中的表达水平及其变化的影响，验证miRNA对ANGPTL4的靶向调控，并确定miRNA对ANGPTL4的靶向调控是否对OSCC的增殖和耐药性存在影响。本研究将对OSCC的诊断、治疗以及预后预测提供一定的参考作用。按照MDAR报告清单呈现以下文章。（可在https://t.cn/A6YN3H95获取）
·方法
组织收集
本研究符合赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki, 2013年修订版）。该研究已得到中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准（No. SYSEC-KY-KS-2021-028）。从中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科获取了36对来自口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者的肿瘤组织（tumor tissues , T）和癌旁组织（paracancerous tissues, P）。所有患者均为原发OSCC，未接受过术前放疗或化疗。所有样本均存储在-80℃下备用。所有患者均已签署知情同意书。使用了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库来分析头颈鳞状细胞癌（HNSC）和正常组织中ANGPTL4的表达。
细胞培养和处理
购买了来自中国科学院（上海，中国）的HOK、SCC9、UM1、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞系，并使用上述细胞开展实验。所有细胞系均培养于含10％胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，美国）和1％青霉素-链霉素溶液（Thermo Fisher，美国）的DMEM（Thermo Fisher，美国）或DMEM-F12（Thermo Fisher，美国）所配完全培养基，温度37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中。其中HOK、HSC6、HSC3、CAL27和OSCC3细胞培养使用DMEM，SCC9和UM1细胞培养使用F12/DMEM。
RNA提取和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
总RNA使用TRIzol试剂（TaKaRa，日本）提取，按照制造商说明，使用ABI 9700实时PCR仪（ABI，美国）反转录为cDNA。MicroRNA反转录引物按照茎环法[10]设计。1 µL的cDNA与TB Green® Premix Ex Taq™ II (#RR820B, TaKaRa, Japan）按照制造商的说明，在20 µL反应体积下混合。在Light Cycler 480 II实时PCR系统（Roche，瑞士）中测定mRNA的相对表达，使用统计软件进行统计分析。反应条件如下：94℃ 2 min，94℃ 20秒，58℃ 20秒，72℃ 20秒，共40循环，所有反应均重复3次。根据GAPDH和U6的表达进行标准化后，使用2−ΔΔCt方法计算ANGPTL4和microRNA的相对表达水平。如表S1所示，所有PCR引物均从IGEBIO（广州，中国）购买。
Western blot检测
为提取蛋白，将细胞用预冷PBS洗涤2次，刮取收集细胞，然后在含有1%蛋白酶抑制剂（#CW2200S，CWBIO，中国）的裂解缓冲液（#01408，Beyotime，中国）中裂解。离心后，收集上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒（#CW0014S，CWBIO，中国）确定蛋白浓度。稀释并混合上样缓冲液（#CW0027S，CWBIO，中国），并在95℃加热5 min使蛋白变性。按照Beyotime聚丙烯酰胺凝胶试剂盒的说明准备SDS-PAGE凝胶。电泳后（90 V，1.3 h），将蛋白转移到PVDF膜（#P0021S，Beyotime，中国）（250 mA，70 min）。将PVDF膜在含有5％脱脂牛奶和0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中孵育1 h，以封闭蛋白。将一抗ANGPTL4 (#18374-1-AP, Proteintech, USA）和GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, USA）在含有0.1％ Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白抗体稀释液中溶解，稀释比例为1:1000，然后在4℃摇床中孵育16 h（过夜孵育）。将膜在含有0.1％ Tween-20的TRIS缓冲盐水中洗涤。然后在含有0.1％Tween-20 Tris缓冲盐水的5％牛血清白蛋白中，以1:1,000的稀释比例孵育二抗，包括山羊抗小鼠IgG-HRP (#sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, USA）和山羊抗兔IgG-HRP (#sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, USA)1 h。根据标准流程进行显色，拍照和凝胶图像分析。
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吸烟、免疫和DNA损伤
·烟草毒理学和致畸作用
非吸烟者的正常肺含有作为免疫细胞的肺泡巨噬细胞。烟草产生的烟雾进入肺部时，会引发巨噬细胞和中性粒细胞在支气管和肺上皮细胞的大量聚集。吸烟使上皮组织直接暴露于60种以上的强化学致癌物中，这些致癌物可能对喉、支气管和肺上皮细胞造成DNA损伤。烟草烟雾中最常见的化合物包括尼古丁、甲醛、氨、一氧化碳、二氧化碳、苯并芘、焦油、丙酮、羟醌、镉和氮氧化物等[1]。
焦油和尼古丁对先天免疫反应具有免疫抑制作用，含有高浓度焦油和尼古丁的烟草制品引起的免疫变化最大。例如，香烟烟雾会完全抑制或降低中性粒细胞的吞噬作用，并影响免疫细胞趋化性、运动和细胞信号传导。它还会抑制活性氧（ROS）的释放，从而影响中性粒细胞和其他先天免疫细胞清除病原体[1]。
除了香烟、雪茄、烟斗的烟雾中存在的化学致癌物和影响表观遗传的化学物外，尼古丁也可能导致肺癌的发生。呼吸道上皮细胞的烟草相关损伤和尼古丁对细胞程序性死亡（细胞凋亡）的抑制作用，可能是恶性肿瘤细胞增殖和多发性上皮病变（即区域突变）形成的重要因素。作为细胞保护性机制，细胞凋亡可以防止发生不可逆DNA损伤的细胞继续增殖[2]。在吸烟者和戒烟者的肺部上皮细胞中发现了许多区域性突变，每个细胞周围均存在炎症反应。目前认为，吸烟会导致慢性炎症，并通过促进细胞的恶性转化和存活导致暴露于化学致癌物的肺上皮细胞不断增殖，最终形成癌细胞[3]。区域性突变从炎症反应中发生免疫逃逸后，逐渐促进基质形成、血管生成，促进细胞快速增殖，最终导致肺上皮性肿瘤。
烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）主要存在于肺上皮细胞表面，间皮瘤、SCLC和NSCLC细胞系也存在nAChR，尼古丁不仅是一种有毒且成瘾度高的生物碱，也是nAChR激动剂，对促凋亡信号通路具有抑制作用。当然，尼古丁也会快速被肺部吸收并进入血液，到达中枢神经系统的奖赏中心神经元上的胆碱能受体，导致强烈成瘾。此外，尼古丁还作用于周围神经系统中的烟碱受体[4,5]。
nAChR通过上调生长因子[例如促进血管生成的血管内皮生长因子（VEGF）和促进基质组织生长的成纤维细胞生长因子（FGF）]参与癌细胞生长的自分泌增殖网络。因此，尼古丁可能发挥了多种效用，包括细胞增殖和血管生成。炎性细胞因子可以导致组织损伤，尼古丁还可以下调肺细胞中的抗炎microRNA，刺激炎性细胞因子表达。这些研究结果表明，尼古丁可能在人肺癌的发病机制以及特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺气肿致病中直接发挥作用[6-10]。
根据毒理学研究，尼古丁为剧毒物质，成年人致死剂量约为1.0 mg/kg或~60 mg每平均单位的身体体质。口服摄入4~8 mg尼古丁可导致呕吐、高血压、头晕、抽搐和心动过速，甚至房颤，具体情况取决于尼古丁摄入者的体重[11]。糖果、口香糖和电子烟中尼古丁的潜在毒性也不应忽视，尤其对于孩子而言。例如，1 g尼古丁就足以让蹒跚学步的孩子住进医院急诊科[12]。
·烟草对免疫力的影响
如前所述，肺部慢性炎症的引发是吸烟对免疫力重要影响之一，主要源于肺上皮细胞反复暴露于烟雾中和新区域突变的增加，而慢性炎症还随着时间的推移而不断累积。巨噬细胞被认为是慢性炎症的主要参与者，与非吸烟者相比，吸烟者体内高水平促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的释放增加，可导致组织破坏[13,14]。
活化的巨噬细胞上对粘附分子的表达增强，进一步加强了与T细胞的细胞间交互作用，导致细胞因子的合成与释放。巨噬细胞分泌IL-1激活辅助性T淋巴细胞（CD4+Th），使其迅速克隆增殖。辅助性T细胞分泌白细胞介素2（IL-2），激活细胞毒性T淋巴细胞效应T细胞（CD8+ T 细胞）。非吸烟者肺部最主要的吞噬细胞是肺泡巨噬细胞，研究显示，吸烟者支气管肺泡液（BAL）中的肺泡巨噬细胞数量较之非吸烟者显著增加。这些巨噬细胞还会发生表型改变，表现在其吞噬活性显著降低，继而导致其从肺中清除炎症碎片和使中性粒细胞凋亡的能力下降[11]。
Heguy等人对吸烟者和非吸烟者的肺泡巨噬细胞进行基因分型发现，与非吸烟者相比，吸烟者中有40个基因表达增加，35个基因表达降低。大多数改变的基因在炎症反应、细胞粘附、细胞外基质、蛋白水解调节、信号转导、溶酶体功能、抗氧化活性和转录因子中发挥作用[15]。
Forsslund等人研究了40名吸烟者、40名非吸烟者和40名已戒烟者的淋巴细胞亚群，包括COPD患者（吸烟者和戒烟者）。他们分析了所有受试者的BAL和外周血发现，较之患有COPD的非吸烟者和戒烟者，吸烟者（无论是否患有COPD）在BAL中具有CD8+T细胞和自然杀伤（NK）T样细胞的百分比更高。然而，吸烟者中CD4+ T细胞的百分比非吸烟者低。在外周血中，两组吸烟者（患有和未患有COPD）的CD4+ T细胞比例增加。与非吸烟者相比，吸烟者活化的幼稚T细胞水平和效应CD4+ T细胞水平也有所增加，尤其对比患有COPD的非吸烟者时。在患有COPD的男性吸烟者中，BAL中CD8+ T 细胞百分比与每日吸烟次数呈正相关关系[16]。
无论是否患有COPD，吸烟者的BAL和外周血中也存在NK细胞（CD56+ CD3-），而 NK CD16+ 水平在未患COPD的非吸烟者外周血中的水平相对较低[17,18]。其他研究发现，香烟烟雾对人NK CD56+ CD3- 中编码干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的基因表达具有抑制活性，此外还会使穿孔素生成、细胞毒性和细胞溶解作用降低[19-21]。
香烟烟雾中还含有高浓度的ROS，最近发表的一项报告显示，香烟烟雾提取物（CSE）可以刺激白细胞介素-17A（IL-17A）的合成，而白细胞介素-17A又通过肺和支气管上皮细胞表面的受体IL-17R诱导白细胞介素-8（IL-8）的产生。IL-17 还通过结合成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞上的受体IL-17RA和IL-17RC激活促炎信号通路；通过从内皮细胞释放IL-8将中性粒细胞募集到呼吸道[22]。尽管炎症反应效应放大，但暴露于烟草烟雾的中性粒细胞的呼吸爆发产生能力丧失、吞噬作用减少，从而导致呼吸道病原体抵抗能力下降[23,24]。
免疫系统总是同时触发促炎和抗炎反应，目的是在消除病原体（或突变蛋白质）的同时，避免发生自身免疫反应。转化生长因子-β（TGF-β）与细胞毒性T细胞表面受体结合，并将其转化为调节性T细胞（Tregs），通过炎症调节过程中起调控作用。在健康吸烟者和COPD患者中发现了三个Tregs亚群：抑制性（rTregs）CD25++CD45RA+，活化的CD+++CD45RA-（aTregs）和促炎性CD25++CD45RA-（FrIII）。FrIII分泌促炎细胞因子，当FrIII种群在三种细胞因子中占主导地位时，炎症反应增强，自身免疫发生风险增加[25]。研究发现，与未患COPD疾病的吸烟者相比，吸烟会损害COPD吸烟者体内Tregs的免疫抑制功能，并通过减少 rTregs的数量、促进患者自身免疫的发生，导致Treg亚群比例失衡。相比之下，一些健康吸烟者体内检测出的 rTreg水平异常增高，而其免疫抑制作用可导致呼吸道感染易感性增加。研究发现，在COPD患者体内，低水平的rTregs和aTregs往往伴随着高比例的FrIII细胞群，这可导致细胞因子分泌增加，并持续引发炎症[26]。
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吸烟、免疫和DNA损伤
·烟草毒理学和致畸作用
非吸烟者的正常肺含有作为免疫细胞的肺泡巨噬细胞。烟草产生的烟雾进入肺部时，会引发巨噬细胞和中性粒细胞在支气管和肺上皮细胞的大量聚集。吸烟使上皮组织直接暴露于60种以上的强化学致癌物中，这些致癌物可能对喉、支气管和肺上皮细胞造成DNA损伤。烟草烟雾中最常见的化合物包括尼古丁、甲醛、氨、一氧化碳、二氧化碳、苯并芘、焦油、丙酮、羟醌、镉和氮氧化物等[1]。
焦油和尼古丁对先天免疫反应具有免疫抑制作用，含有高浓度焦油和尼古丁的烟草制品引起的免疫变化最大。例如，香烟烟雾会完全抑制或降低中性粒细胞的吞噬作用，并影响免疫细胞趋化性、运动和细胞信号传导。它还会抑制活性氧（ROS）的释放，从而影响中性粒细胞和其他先天免疫细胞清除病原体[1]。
除了香烟、雪茄、烟斗的烟雾中存在的化学致癌物和影响表观遗传的化学物外，尼古丁也可能导致肺癌的发生。呼吸道上皮细胞的烟草相关损伤和尼古丁对细胞程序性死亡（细胞凋亡）的抑制作用，可能是恶性肿瘤细胞增殖和多发性上皮病变（即区域突变）形成的重要因素。作为细胞保护性机制，细胞凋亡可以防止发生不可逆DNA损伤的细胞继续增殖[2]。在吸烟者和戒烟者的肺部上皮细胞中发现了许多区域性突变，每个细胞周围均存在炎症反应。目前认为，吸烟会导致慢性炎症，并通过促进细胞的恶性转化和存活导致暴露于化学致癌物的肺上皮细胞不断增殖，最终形成癌细胞[3]。区域性突变从炎症反应中发生免疫逃逸后，逐渐促进基质形成、血管生成，促进细胞快速增殖，最终导致肺上皮性肿瘤。
烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）主要存在于肺上皮细胞表面，间皮瘤、SCLC和NSCLC细胞系也存在nAChR，尼古丁不仅是一种有毒且成瘾度高的生物碱，也是nAChR激动剂，对促凋亡信号通路具有抑制作用。当然，尼古丁也会快速被肺部吸收并进入血液，到达中枢神经系统的奖赏中心神经元上的胆碱能受体，导致强烈成瘾。此外，尼古丁还作用于周围神经系统中的烟碱受体[4,5]。
nAChR通过上调生长因子[例如促进血管生成的血管内皮生长因子（VEGF）和促进基质组织生长的成纤维细胞生长因子（FGF）]参与癌细胞生长的自分泌增殖网络。因此，尼古丁可能发挥了多种效用，包括细胞增殖和血管生成。炎性细胞因子可以导致组织损伤，尼古丁还可以下调肺细胞中的抗炎microRNA，刺激炎性细胞因子表达。这些研究结果表明，尼古丁可能在人肺癌的发病机制以及特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺气肿致病中直接发挥作用[6-10]。
根据毒理学研究，尼古丁为剧毒物质，成年人致死剂量约为1.0 mg/kg或~60 mg每平均单位的身体体质。口服摄入4~8 mg尼古丁可导致呕吐、高血压、头晕、抽搐和心动过速，甚至房颤，具体情况取决于尼古丁摄入者的体重[11]。糖果、口香糖和电子烟中尼古丁的潜在毒性也不应忽视，尤其对于孩子而言。例如，1 g尼古丁就足以让蹒跚学步的孩子住进医院急诊科[12]。
·烟草对免疫力的影响
如前所述，肺部慢性炎症的引发是吸烟对免疫力重要影响之一，主要源于肺上皮细胞反复暴露于烟雾中和新区域突变的增加，而慢性炎症还随着时间的推移而不断累积。巨噬细胞被认为是慢性炎症的主要参与者，与非吸烟者相比，吸烟者体内高水平促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的释放增加，可导致组织破坏[13,14]。
活化的巨噬细胞上对粘附分子的表达增强，进一步加强了与T细胞的细胞间交互作用，导致细胞因子的合成与释放。巨噬细胞分泌IL-1激活辅助性T淋巴细胞（CD4+Th），使其迅速克隆增殖。辅助性T细胞分泌白细胞介素2（IL-2），激活细胞毒性T淋巴细胞效应T细胞（CD8+ T 细胞）。非吸烟者肺部最主要的吞噬细胞是肺泡巨噬细胞，研究显示，吸烟者支气管肺泡液（BAL）中的肺泡巨噬细胞数量较之非吸烟者显著增加。这些巨噬细胞还会发生表型改变，表现在其吞噬活性显著降低，继而导致其从肺中清除炎症碎片和使中性粒细胞凋亡的能力下降[11]。
Heguy等人对吸烟者和非吸烟者的肺泡巨噬细胞进行基因分型发现，与非吸烟者相比，吸烟者中有40个基因表达增加，35个基因表达降低。大多数改变的基因在炎症反应、细胞粘附、细胞外基质、蛋白水解调节、信号转导、溶酶体功能、抗氧化活性和转录因子中发挥作用[15]。
Forsslund等人研究了40名吸烟者、40名非吸烟者和40名已戒烟者的淋巴细胞亚群，包括COPD患者（吸烟者和戒烟者）。他们分析了所有受试者的BAL和外周血发现，较之患有COPD的非吸烟者和戒烟者，吸烟者（无论是否患有COPD）在BAL中具有CD8+T细胞和自然杀伤（NK）T样细胞的百分比更高。然而，吸烟者中CD4+ T细胞的百分比非吸烟者低。在外周血中，两组吸烟者（患有和未患有COPD）的CD4+ T细胞比例增加。与非吸烟者相比，吸烟者活化的幼稚T细胞水平和效应CD4+ T细胞水平也有所增加，尤其对比患有COPD的非吸烟者时。在患有COPD的男性吸烟者中，BAL中CD8+ T 细胞百分比与每日吸烟次数呈正相关关系[16]。
无论是否患有COPD，吸烟者的BAL和外周血中也存在NK细胞（CD56+ CD3-），而 NK CD16+ 水平在未患COPD的非吸烟者外周血中的水平相对较低[17,18]。其他研究发现，香烟烟雾对人NK CD56+ CD3- 中编码干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的基因表达具有抑制活性，此外还会使穿孔素生成、细胞毒性和细胞溶解作用降低[19-21]。
香烟烟雾中还含有高浓度的ROS，最近发表的一项报告显示，香烟烟雾提取物（CSE）可以刺激白细胞介素-17A（IL-17A）的合成，而白细胞介素-17A又通过肺和支气管上皮细胞表面的受体IL-17R诱导白细胞介素-8（IL-8）的产生。IL-17 还通过结合成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞上的受体IL-17RA和IL-17RC激活促炎信号通路；通过从内皮细胞释放IL-8将中性粒细胞募集到呼吸道[22]。尽管炎症反应效应放大，但暴露于烟草烟雾的中性粒细胞的呼吸爆发产生能力丧失、吞噬作用减少，从而导致呼吸道病原体抵抗能力下降[23,24]。
免疫系统总是同时触发促炎和抗炎反应，目的是在消除病原体（或突变蛋白质）的同时，避免发生自身免疫反应。转化生长因子-β（TGF-β）与细胞毒性T细胞表面受体结合，并将其转化为调节性T细胞（Tregs），通过炎症调节过程中起调控作用。在健康吸烟者和COPD患者中发现了三个Tregs亚群：抑制性（rTregs）CD25++CD45RA+，活化的CD+++CD45RA-（aTregs）和促炎性CD25++CD45RA-（FrIII）。FrIII分泌促炎细胞因子，当FrIII种群在三种细胞因子中占主导地位时，炎症反应增强，自身免疫发生风险增加[25]。研究发现，与未患COPD疾病的吸烟者相比，吸烟会损害COPD吸烟者体内Tregs的免疫抑制功能，并通过减少 rTregs的数量、促进患者自身免疫的发生，导致Treg亚群比例失衡。相比之下，一些健康吸烟者体内检测出的 rTreg水平异常增高，而其免疫抑制作用可导致呼吸道感染易感性增加。研究发现，在COPD患者体内，低水平的rTregs和aTregs往往伴随着高比例的FrIII细胞群，这可导致细胞因子分泌增加，并持续引发炎症[26]。
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Le diremos cómo prevenir la infección por todos los virus, incluido el virus replicón, el virus de la viruela del simio, el virus de la influenza y el nuevo coronavirus.
La vía de contagio de persona a persona es principalmente a través de aerosoles (infección transmitida por el aire), pero al estar envuelto en un sobre (película de sebo), se puede eliminar fácilmente con alcohol.
Los virus ingresan al cuerpo principalmente a través de la membrana de las células respiratorias ACE2 en la cavidad nasal.
Hay dos cavidades nasales, una a la izquierda y otra a la izquierda, en lo profundo de la nariz, y un dolor de cabeza causado por un virus que ingresa a una fosa nasal se llama migraña.
Los dolores de cabeza y la fiebre son fenómenos físicos que ocurren cuando un virus invade la cavidad nasal y las células inmunes como los macrófagos y las células T asesinas se comen y comen el virus.
Las células inmunes son organismos vivos independientes de moho limoso (limo, ameba) que viven en el cuerpo y no protegen la vida humana.
Los mohos mucilaginosos se alimentan de bacterias y virus.
Para prevenir infecciones, si la fosa nasal derecha está afectada, cierre la fosa nasal izquierda, rocíe alcohol etílico de unos 5 a 10 cm delante de la fosa nasal derecha e inhale tanto como pueda.
Haga lo mismo al aplicarlo en la fosa nasal izquierda. Si sientes un hormigueo en la cabeza, hay un virus, y si no, no existe.
¡Eso es todo!
La foto es una imagen tomada con un microscopio electrónico de cómo va muriendo el nuevo coronavirus.
Si le está dando esto a un niño o una persona mayor, cierre los ojos y preste atención al ritmo de su respiración.
Por favor, no lo pongas directamente en tus fosas nasales. La cantidad que rocías e inhalas es muy pequeña, por lo que no supone ningún peligro para tu cuerpo.
Si no cree en la prevención de infecciones con aerosoles nasales, pruébelo cuando tenga dolor de cabeza, fiebre, congestión nasal o secreción nasal y experimentará una cura.
Si te resulta complicado llevar alcohol etílico, rocía un poco de alcohol en tus manos con el pulverizador de alcohol disponible en varias entradas y salidas, tápate la nariz e inhala tanto como puedas para esterilizar los gérmenes que portan el virus.
También es una forma de obtener un resultado negativo en una prueba de PCR, así que pruébalo.
Si se siente mal después de recibir una vacuna, no es por los ingredientes de la vacuna, sino porque las células inmunitarias inducidas por la vacuna atacan las membranas mucosas (órganos viscerales) del cuerpo.
Si es absolutamente necesario vacunarse, coma algas marinas el día de la vacunación antes de vacunarse.
Un componente llamado fucoidan contenido en las algas marinas recubre los órganos internos con membranas mucosas, evitando que sean atacados por las células inmunes.
El vinagre de mekabu (su) y el vinagre de mozuku se venden en los supermercados por 100 yenes por 3 paquetes.
También puedes usar algas de ñame rallado.
El cuerpo humano está formado por alimentos y bacterias que se encuentran en el aire.
Hay 37 billones de células en el cuerpo humano. Hay 1.000 billones de organismos vivos que utilizan el cuerpo humano como huésped, y es el organismo huésped el que controla los pensamientos y la condición física de una persona.
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