大家好,我是你们的科普达人小V,上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点,这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理:
凋亡早期,细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从膜内翻到膜外,这是凋亡的一个典型特征,细胞凋亡处于早期阶段时,仅有PS外翻,而细胞膜仍然完整,随着凋亡进程的推移,细胞除了PS外翻以外,细胞膜通透性会改变,可以简单的理解成凋亡后期,细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂,我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例,试剂盒内一般都是3个组分:两个染料,再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下,能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白,通过在该蛋白上标记的荧光基团,我们就可以标记凋亡细胞了,然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料,就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类:一是无PS外翻,也没有细胞膜破裂的健康细胞(两个染料都染不上),二是处于早期凋亡,有PS外翻但是细胞膜完好的细胞(可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI),三是处于晚期凋亡阶段,既存在PS外翻,也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞(两种染料均可染上),第四类较为特殊,不做赘述,它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞,一般认为这是坏死细胞(可以染上PI,但是无法染上Annexin V-FITC)。
染完色后通过流式细胞仪,我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理,怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身,如何顺利的攻克这个检测呢?
硬核技术一:
细胞收集与染色——如何规范化操作?
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪,因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品,悬浮细胞直接计数,贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作;如果样本是组织,那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了,可以概括成以下几步:
(1) 细胞收集,PBS洗涤
(2) Binding Buffer重悬
(3) 染色
(4) 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤,洗涤时用预冷的PBS洗两遍,然后将PBS吸干净,用Binding Buffer重悬后进行染色,染色时两种染料各加5 µl,避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家,染色时间不建议延长,避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二:
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办?
流式的对照一直很令人头疼,今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外,还需要添加一系列的对照,用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
(1) 空白对照:不进行标记的裸细胞,一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后,细胞本身物理状态是否有变化,也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
(2) 阴性对照:双染的不处理正常细胞,目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外,健康细胞分界线确定建议用这个对照,因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
(3) 单标组:单一染料标记的实验组细胞(有凋亡细胞)。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中,荧光信号除了接收通道以外,还可能被另一通道接收到,影响该通道的数据,因此需要进行“补偿调节”,扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管,所使用样本应该是该染料检测时,细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三:
数据分析——救救孩子,怎么搞分析啊?
流式数据的分析是这个实验的重中之重了,我们应该如何操作,才能够得到漂亮的图呢?
首先,我们来认识一下流式分析的检测原理:流式细胞仪通道中一个个的样本流过,仪器会给它一个激发光,这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收,反映在图上就是下图所示的一个个小点(smooth图不以小点的形式显示),这边需要强调的是,流式通道一个个通过去的样品,不一定全是细胞,体系内的细胞碎片,各种小分子杂质只要能够被流式检测到,反映在图谱上,就是一个点。所以严格来说,流式图谱中的点,每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件,我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤:画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱,是FSC-SSC物理图谱(图a),这边是小V做的一个凋亡细胞样品,使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色,上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱,这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC(前向角散射)和SSC(侧向角散射)分别代表了细胞大小和细胞颗粒度,通过这个图谱,我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用,一是如果两种细胞群在一起,细胞有明显的形态区别,可以做初步的分类,另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片,如图a所示,我们能够看到很明显的两个群,右上方一群,左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体,这一群与右上群体具有明显区分度的事件,被判定为细胞碎片,是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢?
大家可以看图b和图d,图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果,图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多,细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下:细胞碎片,请尽力把它排除出你的分析范围!!!
好了,告一段落,搞定了基础的FSC-SSC图谱,成功选到了我们要分析的细胞,也就是做好了第一步:画门。我们接下来应该做什么呢?
2、调补偿
现在的流式细胞仪,调补偿的方法各有不同,有直接上机的时候跑个单染管,仪器自动给你调整好的,也有仪器万事不管,你自己跑完所有样本,回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了,我们来讲一讲后者。
首先,必须调节补偿,细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外,还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子,大家可以看下边这个表格:目标接收通道FL1只能接收到80 %的光,还有20 %散布在其他通道,FL2通道高达10 %,因此不扣除这部分荧光,对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作,就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光,就要准备几种单染管!!
唠完前边这些理论内容,我们来说点实在的。在凋亡实验中,我们如何来调节荧光补偿呢?
这边小V推荐大家拿到原始数据以后,用Flowjo V10进行荧光补偿的调节,软件自动,不用发愁~这个操作分为3步
(1) 在FSC-SSC图中,选出待分析细胞群,一定尽量扔掉细胞碎片!
(2) 打开Flowjo的补偿调节界面,按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择,大家不用在意,请重点关注Sample和Negative,Sample是你的单染管,Negative指的是不含该染料的体系,一般统一用不染色的对照组就行了。
(3) 请点击Apply to Group按钮,选中对应的数据组,简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门,将细胞分为了四个象限(见图4),分别对应了四种不同的染色情况,左下象限是两个染料都没染到的健康细胞,右下是染上了Annexin V-FITC,没染上PI的早期凋亡细胞,右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞(FITC和PI都能染上),但实际情况中,右上象限也是包括了一部分坏死细胞的,但是比例比较小,一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞(不经凋亡,因此没有PS外翻,但是细胞坏死后细胞膜损坏,因此核酸染料可以进入)。
讲完了结果的四个象限划分,我们回到四个象限本身,这个十字门该怎么画呢?
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据,找出两个单染组,然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界,然后在双染的数据中以这两个分界为基准,结合数据的实际分群情况进行微调,就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下,需要一起分析的数据们,都必须用统一的十字门哟!
最后,有几个点需要补充说明一下,也是大家经常遇到的一些问题:
1. 我的细胞贴壁非常的厉害,不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟,怎么办?
遇到这种情况,小V建议你两害相权取其轻,Binding Buffer里最重要的组分是钙离子,建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来,降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久,会引入很多机械性损伤,对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的,但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊?我觉得10分钟染色,好像染得不够多啊?
不可以的哦,10分钟是最优化的染色时间,染色时间过长的情况下会产生假阳性,不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因,就是没办法好好分群,我该怎么画门呢?
这里首先要同情一下这位同学,然后要告诉大家,遇到这种情况,可做一个健康细胞双染(同一份健康细胞,加染料与不加染料,其本底荧光值会有偏移,因此这边必须进行双染),健康细胞肯定是染不上染料的,那么你就得到了一团在左下角的细胞,以一团细胞的边界为标准画十字门,然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式,我该在哪里停止实验啊?
收集好细胞后,经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬,放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长,否则细胞状态容易变差。
友情提醒:如果细胞本身凋亡就非常多,那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断,建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了,如果大家在实验方面有任何疑问, 欢迎随时咨询小V,或直接联系您身边的诺唯赞人,我们将努力为您提供更优质的产品和服务!最后,祝福大家实验顺当结果好,细胞超乖不作妖!
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理:
凋亡早期,细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从膜内翻到膜外,这是凋亡的一个典型特征,细胞凋亡处于早期阶段时,仅有PS外翻,而细胞膜仍然完整,随着凋亡进程的推移,细胞除了PS外翻以外,细胞膜通透性会改变,可以简单的理解成凋亡后期,细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂,我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例,试剂盒内一般都是3个组分:两个染料,再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下,能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白,通过在该蛋白上标记的荧光基团,我们就可以标记凋亡细胞了,然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料,就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类:一是无PS外翻,也没有细胞膜破裂的健康细胞(两个染料都染不上),二是处于早期凋亡,有PS外翻但是细胞膜完好的细胞(可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI),三是处于晚期凋亡阶段,既存在PS外翻,也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞(两种染料均可染上),第四类较为特殊,不做赘述,它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞,一般认为这是坏死细胞(可以染上PI,但是无法染上Annexin V-FITC)。
染完色后通过流式细胞仪,我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理,怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身,如何顺利的攻克这个检测呢?
硬核技术一:
细胞收集与染色——如何规范化操作?
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪,因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品,悬浮细胞直接计数,贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作;如果样本是组织,那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了,可以概括成以下几步:
(1) 细胞收集,PBS洗涤
(2) Binding Buffer重悬
(3) 染色
(4) 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤,洗涤时用预冷的PBS洗两遍,然后将PBS吸干净,用Binding Buffer重悬后进行染色,染色时两种染料各加5 µl,避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家,染色时间不建议延长,避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二:
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办?
流式的对照一直很令人头疼,今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外,还需要添加一系列的对照,用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
(1) 空白对照:不进行标记的裸细胞,一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后,细胞本身物理状态是否有变化,也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
(2) 阴性对照:双染的不处理正常细胞,目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外,健康细胞分界线确定建议用这个对照,因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
(3) 单标组:单一染料标记的实验组细胞(有凋亡细胞)。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中,荧光信号除了接收通道以外,还可能被另一通道接收到,影响该通道的数据,因此需要进行“补偿调节”,扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管,所使用样本应该是该染料检测时,细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三:
数据分析——救救孩子,怎么搞分析啊?
流式数据的分析是这个实验的重中之重了,我们应该如何操作,才能够得到漂亮的图呢?
首先,我们来认识一下流式分析的检测原理:流式细胞仪通道中一个个的样本流过,仪器会给它一个激发光,这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收,反映在图上就是下图所示的一个个小点(smooth图不以小点的形式显示),这边需要强调的是,流式通道一个个通过去的样品,不一定全是细胞,体系内的细胞碎片,各种小分子杂质只要能够被流式检测到,反映在图谱上,就是一个点。所以严格来说,流式图谱中的点,每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件,我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤:画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱,是FSC-SSC物理图谱(图a),这边是小V做的一个凋亡细胞样品,使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色,上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱,这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC(前向角散射)和SSC(侧向角散射)分别代表了细胞大小和细胞颗粒度,通过这个图谱,我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用,一是如果两种细胞群在一起,细胞有明显的形态区别,可以做初步的分类,另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片,如图a所示,我们能够看到很明显的两个群,右上方一群,左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体,这一群与右上群体具有明显区分度的事件,被判定为细胞碎片,是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢?
大家可以看图b和图d,图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果,图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多,细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下:细胞碎片,请尽力把它排除出你的分析范围!!!
好了,告一段落,搞定了基础的FSC-SSC图谱,成功选到了我们要分析的细胞,也就是做好了第一步:画门。我们接下来应该做什么呢?
2、调补偿
现在的流式细胞仪,调补偿的方法各有不同,有直接上机的时候跑个单染管,仪器自动给你调整好的,也有仪器万事不管,你自己跑完所有样本,回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了,我们来讲一讲后者。
首先,必须调节补偿,细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外,还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子,大家可以看下边这个表格:目标接收通道FL1只能接收到80 %的光,还有20 %散布在其他通道,FL2通道高达10 %,因此不扣除这部分荧光,对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作,就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光,就要准备几种单染管!!
唠完前边这些理论内容,我们来说点实在的。在凋亡实验中,我们如何来调节荧光补偿呢?
这边小V推荐大家拿到原始数据以后,用Flowjo V10进行荧光补偿的调节,软件自动,不用发愁~这个操作分为3步
(1) 在FSC-SSC图中,选出待分析细胞群,一定尽量扔掉细胞碎片!
(2) 打开Flowjo的补偿调节界面,按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择,大家不用在意,请重点关注Sample和Negative,Sample是你的单染管,Negative指的是不含该染料的体系,一般统一用不染色的对照组就行了。
(3) 请点击Apply to Group按钮,选中对应的数据组,简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门,将细胞分为了四个象限(见图4),分别对应了四种不同的染色情况,左下象限是两个染料都没染到的健康细胞,右下是染上了Annexin V-FITC,没染上PI的早期凋亡细胞,右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞(FITC和PI都能染上),但实际情况中,右上象限也是包括了一部分坏死细胞的,但是比例比较小,一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞(不经凋亡,因此没有PS外翻,但是细胞坏死后细胞膜损坏,因此核酸染料可以进入)。
讲完了结果的四个象限划分,我们回到四个象限本身,这个十字门该怎么画呢?
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据,找出两个单染组,然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界,然后在双染的数据中以这两个分界为基准,结合数据的实际分群情况进行微调,就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下,需要一起分析的数据们,都必须用统一的十字门哟!
最后,有几个点需要补充说明一下,也是大家经常遇到的一些问题:
1. 我的细胞贴壁非常的厉害,不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟,怎么办?
遇到这种情况,小V建议你两害相权取其轻,Binding Buffer里最重要的组分是钙离子,建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来,降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久,会引入很多机械性损伤,对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的,但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊?我觉得10分钟染色,好像染得不够多啊?
不可以的哦,10分钟是最优化的染色时间,染色时间过长的情况下会产生假阳性,不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因,就是没办法好好分群,我该怎么画门呢?
这里首先要同情一下这位同学,然后要告诉大家,遇到这种情况,可做一个健康细胞双染(同一份健康细胞,加染料与不加染料,其本底荧光值会有偏移,因此这边必须进行双染),健康细胞肯定是染不上染料的,那么你就得到了一团在左下角的细胞,以一团细胞的边界为标准画十字门,然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式,我该在哪里停止实验啊?
收集好细胞后,经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬,放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长,否则细胞状态容易变差。
友情提醒:如果细胞本身凋亡就非常多,那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断,建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了,如果大家在实验方面有任何疑问, 欢迎随时咨询小V,或直接联系您身边的诺唯赞人,我们将努力为您提供更优质的产品和服务!最后,祝福大家实验顺当结果好,细胞超乖不作妖!
#男人生育能力是否有年限?#
关于老夫仍能生育之事,曾有外国媒体报道英国有一名120岁老翁仍能使女方受孕的事就是一个很好的例证。
针对男人生育年限的问题,慕尼黑的马克思·普朗克研究中心做了一个有趣的实验。他们选出100名从60-89岁的祖父和100名从24-33岁的父亲作比较。将这两组男人的精虫和田鼠卵放在一起,加入一些酵素后,发现两组结合率都达54%,这显示老年人的精子并不衰老。接着进一步分析两组男人的精液。结果发现,祖父组的精子密度平均每毫升有1.2亿个精虫,父母组却只有0.78亿个。他还发现老年人精液中的精子密度虽高,但活动力明显降低。不动的精子与畸形精子数都增加了20%,此外,精子代谢所需的果酯浓度亦减低,代谢后的废物增多。
如何从临床上决定男人的“青春程度”?生殖医学专家指出:要看睾丸的硬度、房事的频率、全身的身体状况(如高血压、糖尿病、心脏病或气喘病等),必要时,再抽血测男性荷尔蒙浓度作为补证。从临床观察绘出的曲线来看,31岁应该是男性“青春程度”的高峰。
英国牛津大学医学院的卡尔布莱恩博士在对500名60至70岁男人的问卷调查中,发现老年人的性生活状态和婚姻有密切的关系。221名独身老人中只有7%有性生活。279名有伴侣的老人则有54%还维持着每星期l~3次左右的性行为。75岁才慢慢减少。男人的性趣“越磨趋利”,年轻时在性方面活跃的人,较能维持老年的性生活。
综上所述,男人的生育能力是没有年龄的上限,然而男人上了年纪后,精液的品质较差,精子品质的优劣关系到胚胎素质,太差的精子和卵子形成的胚胎,常引起早期流产,也影响到下一代的素质。
关于老夫仍能生育之事,曾有外国媒体报道英国有一名120岁老翁仍能使女方受孕的事就是一个很好的例证。
针对男人生育年限的问题,慕尼黑的马克思·普朗克研究中心做了一个有趣的实验。他们选出100名从60-89岁的祖父和100名从24-33岁的父亲作比较。将这两组男人的精虫和田鼠卵放在一起,加入一些酵素后,发现两组结合率都达54%,这显示老年人的精子并不衰老。接着进一步分析两组男人的精液。结果发现,祖父组的精子密度平均每毫升有1.2亿个精虫,父母组却只有0.78亿个。他还发现老年人精液中的精子密度虽高,但活动力明显降低。不动的精子与畸形精子数都增加了20%,此外,精子代谢所需的果酯浓度亦减低,代谢后的废物增多。
如何从临床上决定男人的“青春程度”?生殖医学专家指出:要看睾丸的硬度、房事的频率、全身的身体状况(如高血压、糖尿病、心脏病或气喘病等),必要时,再抽血测男性荷尔蒙浓度作为补证。从临床观察绘出的曲线来看,31岁应该是男性“青春程度”的高峰。
英国牛津大学医学院的卡尔布莱恩博士在对500名60至70岁男人的问卷调查中,发现老年人的性生活状态和婚姻有密切的关系。221名独身老人中只有7%有性生活。279名有伴侣的老人则有54%还维持着每星期l~3次左右的性行为。75岁才慢慢减少。男人的性趣“越磨趋利”,年轻时在性方面活跃的人,较能维持老年的性生活。
综上所述,男人的生育能力是没有年龄的上限,然而男人上了年纪后,精液的品质较差,精子品质的优劣关系到胚胎素质,太差的精子和卵子形成的胚胎,常引起早期流产,也影响到下一代的素质。
昨天晚上三个小时的飞机,两个多小时都在拍照。拍了很多废片,最后只能选出废片中算能看的四张
(P123都是废片们)
好难拍的星空,在这之前的目标就是拍出星星来,虽然没想象中的好,但是有拍出来一点点还是有点开心的。摄影真的是个累活儿,也是个技术活儿。比去年摄影课瞎交作业难多了。路还长...要学的还很多...
飞机里有光,拿衣服堵光也是心累然后快门速度慢,就不能抖,端着相机一直怼着,导致今早起床胳膊好酸啊...
然后今天又把头发剪短了一点也不是我想象中的亚子
(P123都是废片们)
好难拍的星空,在这之前的目标就是拍出星星来,虽然没想象中的好,但是有拍出来一点点还是有点开心的。摄影真的是个累活儿,也是个技术活儿。比去年摄影课瞎交作业难多了。路还长...要学的还很多...
飞机里有光,拿衣服堵光也是心累然后快门速度慢,就不能抖,端着相机一直怼着,导致今早起床胳膊好酸啊...
然后今天又把头发剪短了一点也不是我想象中的亚子
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