#如何用电转拯救我们难转染的细胞?
当我们做转染实验的时候,总会遇到一些难转染的细胞。恰巧课题组研究的是原代细胞、神经细胞或者是免疫细胞,化学转染方法反复试验失败,这时候就得借助电转来帮助我们推进实验进程了。
对于贴壁细胞和悬浮细胞,在电转前需要进行不同的处理。
贴壁细胞
电穿孔前一天,通过胰酶消化释放贴壁细胞,将细胞转移到含新鲜生长培养基的75cm2 细胞瓶中,接种密度应保证电穿孔当天细胞能够达到50%~70%的汇合度(多数细胞系为每次电穿孔1 X 105 ~ 10 X105细胞)。
实验当天,吸出生长培养基, PBS 洗涤细胞,胰酶消化释放贴壁细胞。取胰酶消化的细胞悬液,用血细胞计数板计数细胞密度。细胞悬液于室温下500g 离心5min 。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~ 5 X 106 细胞/mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
悬浮细胞
电穿孔前一天,于75cm2 细胞瓶中用新鲜生长培养基稀释细胞, 以保证电穿孔当天细胞能够达到指数生长中期的汇合度( 0. 5 X 106~4 X 106 个细胞/mL ) 。计数细胞并按上述离心收集细胞。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~5 X 106 个细胞/mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
电穿孔操作步骤
1. 在电穿孔仪器上设置参数。根据细胞类型选择预设程序或优化程序。对于指数程序(即指数衰减脉冲) , 通常电容为1050μF , 电压在200 ~ 350V 。一般260V 起始电压、以50V递增对大多数细胞有效。内部阻抗设为无限大。
2.向电穿孔杯中加入10 ~ 50μg 质粒DNA 。如有必要, 可加入运载DNA,使DNA 总量达到120μg 。
3.向电穿孔杯中加入细胞,轻轻反复吹打使细胞和DNA 混匀。
4. 将电穿孔杯放进电穿孔仪,盖上盖子,进行一次电脉冲。
5. 立即向电穿孔杯中加入0.5mL 生长培养基,然后将电击后的细胞转移到合适大小的组织培养皿或多孔板中。如有必要, 用生长培养基漂洗0.2cm 或0.4cm 电穿孔杯,然后将漂洗液加到培养皿或培养板内的细胞中。
6.对每个样品和每个电压增量均重复步骤5 和步骤6 。记录每个电穿孔杯的实际脉冲时间和时间常数以便于各次实验间的比较。对于哺乳动物细胞,最适条件是场强为400 ~ 900V/cm、脉冲时间或时间常数为10 ~ 40ms 。轻轻晃动平板以使细胞均匀分布于整个孔或培养皿。
7.将培养皿或培养板放到含5 %~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养细胞6 ~ 24h 。
8.检测细胞活力。
9. 如要分离稳定转染体,可按分离步骤操作。
10.对于瞬时表达,于电穿孔后24 ~96h对细胞进行检测。
同时,电穿孔效率受以下几种因素的影响:
1.外加电场的强度。电压过低,培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过;电压过高,细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系, 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔, 20% ~ 50%的细胞能够存活(根据台盼蓝拒染法的检测结果)。
2.电脉冲时间的长短。通常对细胞进行单次电脉冲。电脉冲的持续时间、电场形状和强度由电源容量及电穿孔杯尺寸决定。多数电穿孔装置允许研究者控制脉冲参数,电穿孔仪有指数衰减波和方形波两种电脉冲形状可供选择。
3. 温度。有些研究者报道, 电穿孔过程中将细胞维持在室温时瞬时表达水平最高;而有的将细胞保持在0 °C 获得了更好的结果。造成以上差异的原因可能是细胞类型不同或电穿孔过程中产热量不同, 较高电压(大于1000V/cm)、较长时间电脉冲(大于l00ms) 的情况容易产生较多的热量。电脉冲处理后再将细胞于电穿孔室内孵育l ~2min 可提高瞬时表达效率 。
4.DNA 的构象与浓度。虽然线性和环状DNA 均能够通过电穿孔进行转染,但采用线性DNA 进行瞬时表达和稳定转化的水平均更高些 。采用1 ~40μg/mL 浓度的DNA 可获得高效的转染。质粒纯度也是影响电穿孔效率的重要因素。
5.培养基的离子成分。用缓冲盐溶液(如HEPES 盐缓冲液)悬浮细胞,转染效率比用含甘露糖或蔗糖等非离子物质的缓冲液高数倍。
6.细胞的生理状态。生长活跃、状态健康、无污染、最好低代次的细胞可获得最佳转染效果。
当我们做转染实验的时候,总会遇到一些难转染的细胞。恰巧课题组研究的是原代细胞、神经细胞或者是免疫细胞,化学转染方法反复试验失败,这时候就得借助电转来帮助我们推进实验进程了。
对于贴壁细胞和悬浮细胞,在电转前需要进行不同的处理。
贴壁细胞
电穿孔前一天,通过胰酶消化释放贴壁细胞,将细胞转移到含新鲜生长培养基的75cm2 细胞瓶中,接种密度应保证电穿孔当天细胞能够达到50%~70%的汇合度(多数细胞系为每次电穿孔1 X 105 ~ 10 X105细胞)。
实验当天,吸出生长培养基, PBS 洗涤细胞,胰酶消化释放贴壁细胞。取胰酶消化的细胞悬液,用血细胞计数板计数细胞密度。细胞悬液于室温下500g 离心5min 。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~ 5 X 106 细胞/mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
悬浮细胞
电穿孔前一天,于75cm2 细胞瓶中用新鲜生长培养基稀释细胞, 以保证电穿孔当天细胞能够达到指数生长中期的汇合度( 0. 5 X 106~4 X 106 个细胞/mL ) 。计数细胞并按上述离心收集细胞。
用适当的电穿孔缓冲液按1 X 106~5 X 106 个细胞/mL 的密度重悬细胞沉淀。轻轻吹打细胞获得均一悬液。
电穿孔操作步骤
1. 在电穿孔仪器上设置参数。根据细胞类型选择预设程序或优化程序。对于指数程序(即指数衰减脉冲) , 通常电容为1050μF , 电压在200 ~ 350V 。一般260V 起始电压、以50V递增对大多数细胞有效。内部阻抗设为无限大。
2.向电穿孔杯中加入10 ~ 50μg 质粒DNA 。如有必要, 可加入运载DNA,使DNA 总量达到120μg 。
3.向电穿孔杯中加入细胞,轻轻反复吹打使细胞和DNA 混匀。
4. 将电穿孔杯放进电穿孔仪,盖上盖子,进行一次电脉冲。
5. 立即向电穿孔杯中加入0.5mL 生长培养基,然后将电击后的细胞转移到合适大小的组织培养皿或多孔板中。如有必要, 用生长培养基漂洗0.2cm 或0.4cm 电穿孔杯,然后将漂洗液加到培养皿或培养板内的细胞中。
6.对每个样品和每个电压增量均重复步骤5 和步骤6 。记录每个电穿孔杯的实际脉冲时间和时间常数以便于各次实验间的比较。对于哺乳动物细胞,最适条件是场强为400 ~ 900V/cm、脉冲时间或时间常数为10 ~ 40ms 。轻轻晃动平板以使细胞均匀分布于整个孔或培养皿。
7.将培养皿或培养板放到含5 %~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养细胞6 ~ 24h 。
8.检测细胞活力。
9. 如要分离稳定转染体,可按分离步骤操作。
10.对于瞬时表达,于电穿孔后24 ~96h对细胞进行检测。
同时,电穿孔效率受以下几种因素的影响:
1.外加电场的强度。电压过低,培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过;电压过高,细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系, 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔, 20% ~ 50%的细胞能够存活(根据台盼蓝拒染法的检测结果)。
2.电脉冲时间的长短。通常对细胞进行单次电脉冲。电脉冲的持续时间、电场形状和强度由电源容量及电穿孔杯尺寸决定。多数电穿孔装置允许研究者控制脉冲参数,电穿孔仪有指数衰减波和方形波两种电脉冲形状可供选择。
3. 温度。有些研究者报道, 电穿孔过程中将细胞维持在室温时瞬时表达水平最高;而有的将细胞保持在0 °C 获得了更好的结果。造成以上差异的原因可能是细胞类型不同或电穿孔过程中产热量不同, 较高电压(大于1000V/cm)、较长时间电脉冲(大于l00ms) 的情况容易产生较多的热量。电脉冲处理后再将细胞于电穿孔室内孵育l ~2min 可提高瞬时表达效率 。
4.DNA 的构象与浓度。虽然线性和环状DNA 均能够通过电穿孔进行转染,但采用线性DNA 进行瞬时表达和稳定转化的水平均更高些 。采用1 ~40μg/mL 浓度的DNA 可获得高效的转染。质粒纯度也是影响电穿孔效率的重要因素。
5.培养基的离子成分。用缓冲盐溶液(如HEPES 盐缓冲液)悬浮细胞,转染效率比用含甘露糖或蔗糖等非离子物质的缓冲液高数倍。
6.细胞的生理状态。生长活跃、状态健康、无污染、最好低代次的细胞可获得最佳转染效果。
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#健康小贴士# 40个难找的小妙方,家家都需要,一定要收藏!
1、落枕的简易疗法
用毛巾浸热水拧干后,敷患处,反复几次即愈。
2、当眼中有异物时
用同侧手拇指,食指轻轻拉开上眼皮,头微低,然后用力咳嗽几下,眼内异物就会震出。
3、当石灰飞入眼睛
热辣难忍时,只要滴少许糖水。就可解除痛苦。
4、红花绿叶茶
取绿茶10克、藏红花5克,泡水晨饮,连喝半个月,对尿酸高有一定调理效果。
5、茵陈枸杞茶
取红景天3克,藏茵陈1克,枸杞5克,泡水日常饮用,对于缺氧、肥胖、血脂高的老年朋友,能起到强身健体、调整呼吸的效果。
6、治冠心病
丹参10克、西洋参6克、炙远志6克、陈皮10克、法半夏10克、茯苓15克、枳实10克、竹茹10克、炙甘草6克、炒酸枣仁10克。此方名叫十味温胆汤,对治疗冠心病心气虚证、心血瘀阻证、痰瘀互结证都有良效,适用于冠心病引起的胸闷、胸痛、心悸等症状。10-15剂为一疗程。
7、老丝瓜藤配红糖水祛风湿
准备霜后的丝瓜藤500~1000克,把它焙干,然后研成面,每次取2~3克,配红糖水冲服,一般每日3次,坚持服用,风湿症状就会有所缓解。
8、黄芪乌梅汤养肝安眠
黄芪50~200克,乌梅20~50克(根据血糖高低调整)。每次加水1升,煎30分钟,备用。每顿饭前30分钟服300毫升。本方特别适合糖人中虚热烦渴的患者,但不适用于消瘦患者和胃经常泛酸的人群。
9、苦荞面糊糊润燥降糖
取苦荞面500克,蒸30分钟后备用。每顿饭前取2~3勺(30克左右),每天3次,开水冲成面糊糊饮用。
10、打嗝不止
请你对着镜子看看自己的舌苔,如果上面像是积了一层霜,打嗝不止就很可能是因胃受寒而引起的。可以试试这个偏方:取生八角100克,用两碗水煎到剩下一碗时,再加些蜂蜜煮沸,调好服用。
11、选柚子的小窍门
选尖不选圆,越尖越好。选大不选小,大个头的会更好。选黄不选青,黄色的比青色的成熟更早。选重不选轻,重的果实比较饱满。用手指按住底端,按不动的最好。
12、接手机别性急
手机在接通瞬间及充电时通话,释放的电磁辐射最大,因此最好在手机响过一两秒后接听电话。充电时则不要接听电话。
13、把茶具放入盐水里浸泡8分钟
这样清洗起来就非常方便。如果把茶具放在盐水里泡半天,那么茶具上的茶垢就会自行脱落。
14、当你非常口渴而家中又无凉开水时
可把装有热水的杯子放入冷水中浸泡,然后在冷水中撒上一把盐,这样能加速开水的冷却。
15、盐水漱口可解辣
吃了辣的东西,感觉受不了,嘴里含一口盐水,漱一下口再吐掉,就会不辣了。因此,可在吃火锅等辣味食物时备上一小碗盐水。
16、剁肉馅时
在刀的两面涂些料酒,刀面上就不会粘肉末了。
17、将待熟的香蕉放入冰箱内贮存
能使香蕉在较长时间内保鲜,即使外皮变色,里面也一样新鲜如初。
18、商品的价格标签很难撕掉
但只要用吹风机对着标签吹,等吹到标签的胶热了,就可以很容易地把标签撕下来了。
19、皮包上有了污渍或者是脏了的话
可以用棉花蘸风油精擦拭。
20、若有小面积皮肤损伤或烧伤、烫伤
抹上少许牙膏,可立即止血止痛,也可防止感染,效果颇佳。
21、巧用白酒去除胶鞋异味
穿新胶鞋前,用嘴含白酒,均匀地喷在胶鞋的海绵底上,到海绵底不再吸收为止,然后晾干,以后穿起来臭味就少。旧胶鞋洗净后也可用此法除臭。
22、洗头时
在水中放少许盐,也可以预防脱发。
23、刷牙时在牙膏上加上一点小苏达
刷三次后牙齿洁白如玉,牙锈自然脱落。
24、淘米水洗纺织物
白色的门窗、床单等,可用淘米水进行浸泡冲洗,具有明显的除垢去污和增白的效果。
25、当冰箱需要除霜时
首先切断冰箱的电源,然后使用电风扇或者电吹风对准冷冻室开到最大挡位,这样经过风吹,霜层会融化得非常快。
26、房间周围角落或地毯和墙壁的接缝处
如果遇到比较顽固的污垢,可以用牙刷蘸洗涤剂刷除,再用水擦拭干净即可。
27、电池可除衣服静电
随时准备一节小的干电池,若衣服起静电,就用电池的正极在衣服上面擦几下,即可去掉静电。
28、晒棉被时盖块黑布
晒棉被时,可在棉被上盖一层黑色的大塑料袋或一大块黑布。由于黑色能吸热;因此可以迅速吸收阳光,让棉被充分享受到太阳的热量。
29、牛仔裤穿时间长了就会褪色
可以把新买来的牛仔裤放入浓盐水中浸泡12小时后,再用清水洗净,以后再洗涤时就不会褪色了。
30、用洁厕灵当疏通剂
隔三差五地将适量洁厕灵倒入马桶,盖上马桶盖闷一会儿,再用水冲洗,能保持马桶通畅。
31、消灭老鼠巧法
将面粉炒熟加点食油,然后拌上干水泥,放在老鼠经常出入的地方。水泥无味,老鼠嗅到食物与油香便吞吃起来,吃后喝水,造成梗阻而死亡。
32、使衣物香气袭人
用完的香水瓶、化妆水瓶等不要立即扔掉,把它们的盖打开,放在衣箱或衣柜里,会使衣物变得香气袭人。
33、擦玻璃镜污垢法
小镜或橱镜等有了污垢,可用软布浸湿煤油或蘸蜡擦拭,切不可用水擦,用水擦,不但镜面模糊不清,且易腐蚀玻璃。
34、饼干潮了怎么变脆
把受潮发软的饼干,摊开放在盘子里,直接放进冰箱的冷藏室,冷藏一两天就可以回脆了。回脆期间注意:不要和生食同时存放。
35、热水泡豆腐除腥味
下锅前将豆腐放入热水中浸泡5~10分钟,能除掉异味。在热水中加点盐还能让豆腐更紧实,不易破碎。
36、煮饺子加点盐
煮饺子时要添足水,待水开后加入2%的食盐,溶解后再下饺子,能增加面筋的韧性,饺子不会粘皮、粘底,饺子的色泽会变白,汤清饺香。
37、炖鸡汤时
可以加些冬瓜、蘑菇之类的吸油的东西一起烧,就感觉不到油了。最好加点酸笋,能够很好的中和汤内的油味,增加汤的鲜亮适口和鲜美度。
38、冻鱼快速解冻
将已冰冻的鱼从冰箱里拿出来,放入盆中,然后倒进清水和适量的醋,浸泡5分钟后即可解冻。
39、抹牙膏去蒜味
做饭时,总会用到葱姜蒜等味道强烈的调料,这种味道往往会在手上留很久,用普通的洗手液根本没办法马上清除。这时你可以用些牙膏挤在手上,牙膏会帮你迅速清除难闻的味道,让“大蒜手”快速消失。
40、花椒防油溢
用油炸食物时,烧到沸点的食油有时会从锅中溢出来,既易烫伤人,又易引起火灾,很难处理。其实只要往油锅里丢进几粒花椒,这一问题可迎刃而解。
1、落枕的简易疗法
用毛巾浸热水拧干后,敷患处,反复几次即愈。
2、当眼中有异物时
用同侧手拇指,食指轻轻拉开上眼皮,头微低,然后用力咳嗽几下,眼内异物就会震出。
3、当石灰飞入眼睛
热辣难忍时,只要滴少许糖水。就可解除痛苦。
4、红花绿叶茶
取绿茶10克、藏红花5克,泡水晨饮,连喝半个月,对尿酸高有一定调理效果。
5、茵陈枸杞茶
取红景天3克,藏茵陈1克,枸杞5克,泡水日常饮用,对于缺氧、肥胖、血脂高的老年朋友,能起到强身健体、调整呼吸的效果。
6、治冠心病
丹参10克、西洋参6克、炙远志6克、陈皮10克、法半夏10克、茯苓15克、枳实10克、竹茹10克、炙甘草6克、炒酸枣仁10克。此方名叫十味温胆汤,对治疗冠心病心气虚证、心血瘀阻证、痰瘀互结证都有良效,适用于冠心病引起的胸闷、胸痛、心悸等症状。10-15剂为一疗程。
7、老丝瓜藤配红糖水祛风湿
准备霜后的丝瓜藤500~1000克,把它焙干,然后研成面,每次取2~3克,配红糖水冲服,一般每日3次,坚持服用,风湿症状就会有所缓解。
8、黄芪乌梅汤养肝安眠
黄芪50~200克,乌梅20~50克(根据血糖高低调整)。每次加水1升,煎30分钟,备用。每顿饭前30分钟服300毫升。本方特别适合糖人中虚热烦渴的患者,但不适用于消瘦患者和胃经常泛酸的人群。
9、苦荞面糊糊润燥降糖
取苦荞面500克,蒸30分钟后备用。每顿饭前取2~3勺(30克左右),每天3次,开水冲成面糊糊饮用。
10、打嗝不止
请你对着镜子看看自己的舌苔,如果上面像是积了一层霜,打嗝不止就很可能是因胃受寒而引起的。可以试试这个偏方:取生八角100克,用两碗水煎到剩下一碗时,再加些蜂蜜煮沸,调好服用。
11、选柚子的小窍门
选尖不选圆,越尖越好。选大不选小,大个头的会更好。选黄不选青,黄色的比青色的成熟更早。选重不选轻,重的果实比较饱满。用手指按住底端,按不动的最好。
12、接手机别性急
手机在接通瞬间及充电时通话,释放的电磁辐射最大,因此最好在手机响过一两秒后接听电话。充电时则不要接听电话。
13、把茶具放入盐水里浸泡8分钟
这样清洗起来就非常方便。如果把茶具放在盐水里泡半天,那么茶具上的茶垢就会自行脱落。
14、当你非常口渴而家中又无凉开水时
可把装有热水的杯子放入冷水中浸泡,然后在冷水中撒上一把盐,这样能加速开水的冷却。
15、盐水漱口可解辣
吃了辣的东西,感觉受不了,嘴里含一口盐水,漱一下口再吐掉,就会不辣了。因此,可在吃火锅等辣味食物时备上一小碗盐水。
16、剁肉馅时
在刀的两面涂些料酒,刀面上就不会粘肉末了。
17、将待熟的香蕉放入冰箱内贮存
能使香蕉在较长时间内保鲜,即使外皮变色,里面也一样新鲜如初。
18、商品的价格标签很难撕掉
但只要用吹风机对着标签吹,等吹到标签的胶热了,就可以很容易地把标签撕下来了。
19、皮包上有了污渍或者是脏了的话
可以用棉花蘸风油精擦拭。
20、若有小面积皮肤损伤或烧伤、烫伤
抹上少许牙膏,可立即止血止痛,也可防止感染,效果颇佳。
21、巧用白酒去除胶鞋异味
穿新胶鞋前,用嘴含白酒,均匀地喷在胶鞋的海绵底上,到海绵底不再吸收为止,然后晾干,以后穿起来臭味就少。旧胶鞋洗净后也可用此法除臭。
22、洗头时
在水中放少许盐,也可以预防脱发。
23、刷牙时在牙膏上加上一点小苏达
刷三次后牙齿洁白如玉,牙锈自然脱落。
24、淘米水洗纺织物
白色的门窗、床单等,可用淘米水进行浸泡冲洗,具有明显的除垢去污和增白的效果。
25、当冰箱需要除霜时
首先切断冰箱的电源,然后使用电风扇或者电吹风对准冷冻室开到最大挡位,这样经过风吹,霜层会融化得非常快。
26、房间周围角落或地毯和墙壁的接缝处
如果遇到比较顽固的污垢,可以用牙刷蘸洗涤剂刷除,再用水擦拭干净即可。
27、电池可除衣服静电
随时准备一节小的干电池,若衣服起静电,就用电池的正极在衣服上面擦几下,即可去掉静电。
28、晒棉被时盖块黑布
晒棉被时,可在棉被上盖一层黑色的大塑料袋或一大块黑布。由于黑色能吸热;因此可以迅速吸收阳光,让棉被充分享受到太阳的热量。
29、牛仔裤穿时间长了就会褪色
可以把新买来的牛仔裤放入浓盐水中浸泡12小时后,再用清水洗净,以后再洗涤时就不会褪色了。
30、用洁厕灵当疏通剂
隔三差五地将适量洁厕灵倒入马桶,盖上马桶盖闷一会儿,再用水冲洗,能保持马桶通畅。
31、消灭老鼠巧法
将面粉炒熟加点食油,然后拌上干水泥,放在老鼠经常出入的地方。水泥无味,老鼠嗅到食物与油香便吞吃起来,吃后喝水,造成梗阻而死亡。
32、使衣物香气袭人
用完的香水瓶、化妆水瓶等不要立即扔掉,把它们的盖打开,放在衣箱或衣柜里,会使衣物变得香气袭人。
33、擦玻璃镜污垢法
小镜或橱镜等有了污垢,可用软布浸湿煤油或蘸蜡擦拭,切不可用水擦,用水擦,不但镜面模糊不清,且易腐蚀玻璃。
34、饼干潮了怎么变脆
把受潮发软的饼干,摊开放在盘子里,直接放进冰箱的冷藏室,冷藏一两天就可以回脆了。回脆期间注意:不要和生食同时存放。
35、热水泡豆腐除腥味
下锅前将豆腐放入热水中浸泡5~10分钟,能除掉异味。在热水中加点盐还能让豆腐更紧实,不易破碎。
36、煮饺子加点盐
煮饺子时要添足水,待水开后加入2%的食盐,溶解后再下饺子,能增加面筋的韧性,饺子不会粘皮、粘底,饺子的色泽会变白,汤清饺香。
37、炖鸡汤时
可以加些冬瓜、蘑菇之类的吸油的东西一起烧,就感觉不到油了。最好加点酸笋,能够很好的中和汤内的油味,增加汤的鲜亮适口和鲜美度。
38、冻鱼快速解冻
将已冰冻的鱼从冰箱里拿出来,放入盆中,然后倒进清水和适量的醋,浸泡5分钟后即可解冻。
39、抹牙膏去蒜味
做饭时,总会用到葱姜蒜等味道强烈的调料,这种味道往往会在手上留很久,用普通的洗手液根本没办法马上清除。这时你可以用些牙膏挤在手上,牙膏会帮你迅速清除难闻的味道,让“大蒜手”快速消失。
40、花椒防油溢
用油炸食物时,烧到沸点的食油有时会从锅中溢出来,既易烫伤人,又易引起火灾,很难处理。其实只要往油锅里丢进几粒花椒,这一问题可迎刃而解。
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