客户文献分享| IF=14.612，基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反应癌症免疫疗
本期解读
题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
了解金开瑞iTRAQ定量蛋白质组学技术：https://t.cn/A6V4xP7Y
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题目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy
期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影响因子：14.612/Q1
合作技术：iTRAQ定量蛋白组学
一、研究背景
释放免疫系统的力量被认为是治疗癌症的重要策略。尽管大多数癌症都表达肿瘤特异性抗原，但免疫疗法仍是保守的，反应低且不良反应频繁。一个主要原因是癌症已经获得了抑制抗原呈递的能力。约70-95％的人类癌细胞下调与抗原呈递相关的蛋白质的表达。这些蛋白质的系统性缺乏促使癌细胞逃脱免疫识别。激活免疫系统的努力主要集中在使用拮抗剂或抑制剂靶向某些蛋白质上。但是，单靶标药物的功效是有限的，而免疫疗法为癌症提供了一个有前景的治疗策略。然而，即使在高抗原负担的肿瘤中，全身抑制抗原提呈仍然极大地限制了免疫治疗的应用。在此，研究者构建了一种基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的肿瘤蛋白工程系统，该系统可以自动收集和传递靶向细胞的免疫肿瘤蛋白到免疫细胞中。通过酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽选择性地聚集在酪氨酸酶高表达的黑色素瘤细胞中。然后将富含醌的中间体与肿瘤特异性蛋白通过Michael加成共价连接，形成携带肿瘤蛋白的微纤维，该微纤维可被抗原提呈细胞吞噬，并表现出肿瘤抗原特性以增强免疫效果。在抗原递呈不足的黑色素瘤细胞中，该系统可以成功地富集和运输含有肿瘤抗原的蛋白质到免疫细胞。此外，在小鼠黑色素瘤的体内研究中，DFY三肽经皮传递抑制肿瘤生长和术后复发。
二、技术路线
聚合肽筛选鉴定——聚合肽DFY作用机制解析——DFY作用下功能蛋白差异性分析——肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活机制解析——肿瘤模型DFY抗癌作用验证
三、实验结果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者筛选得到一种可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并观察到在聚合过程中产生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察均表明是由DFY聚合成的微纤维（图1b和图1b）。然后，研究者研究了各种细胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表达的差异，基于CCLE数据库（https://t.cn/Ev9rmGW）分析了TYR基因在740个细胞系中的表达水平，结果表明，与其他癌细胞分型相比，黑色素瘤细胞系表现出最高的TYR基因表达量（图1e）。此外，研究了酪氨酸酶过表达的黑色素瘤细胞中DFY的胞内聚合反应（图1f），结果表明DFY在黑素瘤细胞中的聚合是酪氨酸酶依赖性的。此外，研究者验证了DFY的聚合是否可以在体内原位诱导。将DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁组织中以观察其在肿瘤中的清除情况。如图1i所示，注射的DFY比DFF在肿瘤位置停留的时间更长，相比之下，大多数DFF在肿瘤中被快速清除了，因此推测DFY能在肿瘤组织中特异性聚合。
2. DFY的胞内蛋白捕获。
研究者通过MTT分析表明，DFY在33μM的浓度下可抑制小鼠B16细胞的增殖达57％（图2e），在与各种B16细胞抑制剂孵育后，发现单苯甲酮（酪氨酸酶抑制剂）和谷胱甘肽（GSH）均可将B16细胞从DFY聚合引起的细胞死亡过程中拯救出来（图2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制剂），ferrostatin-1（促肥大症抑制剂），necrostatin-1（坏死性抑制剂），TBHQ和BHA（醌氧化还原酶诱导剂）却无法挽救DFY对细胞的伤害。得出的结论是，单苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用归因于GSH和DFY之间的迈克尔加成。通过荧光显微镜观察，发现长期培养后，微纤维从细胞中释放出来（图4Sd，e）。实验证明DFY收集靶细胞的胞内蛋白，并以类似于坏死的方式将它们转运出细胞，并伴随DFY聚合诱导的细胞死亡。因此，由pDFY携带的肿瘤蛋白的释放可能刺激随后的抗原触发的免疫反应。
3. 交联蛋白的蛋白质组学研究。
由于蛋白质的免疫原性因蛋白质而异，研究者研究了通过抗原工程系统收集的蛋白质类型，与金开瑞合作的串联质谱用于定量分析蛋白质含量。如图3a，b和S5所示，在DFY聚合后，确定了190个上调蛋白和346个下调蛋白（倍数变化1.5和P <0.05，超几何测试）。然后通过GO数据库富集分析了这些差异蛋白的功能。结果表明，这些蛋白质大多数与细胞代谢（氨基酸代谢，糖代谢），能量供应（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白质合成（核糖体）相关（图3c）。发现这些蛋白质在功能上涵盖了细胞最重要的生物学功能（图3d）。差异蛋白主要来自核糖体，线粒体，细胞核和高尔基体。此外，通过STRING功能蛋白缔合网络研究了DFY聚合后减少的蛋白质之间的相互作用（图3e）。来自细胞器的蛋白质，特别是核糖体，线粒体和细胞核中的蛋白质，形成紧密的簇。该结果表明DFY可以特异性地交联来自这些细胞器的蛋白质，从而导致这些蛋白质的显着减少。另外，作为专业的产生黑色素的细胞器，还分析了在DFY处理的黑色素瘤细胞中黑色素体的蛋白质表达（图S5）。GO富集分析的结果表明，用DFY处理后，黑素体中的大多数相关蛋白也被下调。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理论等电点和差异蛋白质脂肪族指数三个指标（图3f），该结果表明被下调的蛋白质可以被DFY结构结合或化学交联。从实验上观察到，DFY处理可抑制线粒体功能，抑制蛋白质合成并损害细胞骨架形成（图S6）。这些实验结果与理论推测吻合良好。
4. 肿瘤蛋白交联pDFY的免疫激活。
为了研究B16细胞释放的纤维是否可以被APC吞噬，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检查了B16和APC（RAW264.7和DC）对DFY或pDFY的摄取（图4a，b）。荧光成像表明DFY在各种细胞中积累，但pDFY倾向于被APC吞噬。该观察证明，纤维携带的抗原蛋白更倾向于递送至APC。为了阐明pDFY携带的肿瘤蛋白是否能增强免疫反应，用流式细胞仪进一步分析了裂解物蛋白交联的pDFY在DCs成熟中的能力（图4c）。与裂解物组相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，与裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY诱导的DC成熟也更为显着（P = 0.0002）。然后将B16蛋白交联的经pDFY处理的B16细胞和脾细胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系统引发针对癌细胞的特异性免疫反应的能力（图4d），研究发现经裂解物@pDFY处理的脾细胞消除了59.3％的B16细胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY处理的脾细胞的混合物仅杀死了不到30％的B16细胞。携带肿瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功触发了针对B16细胞的特异性免疫杀伤。在此基础上，考虑到pDFY的佐剂作用和交联蛋白的强免疫原性，抗原工程系统可作为黑色素瘤治疗的免疫增强疫苗型材料。最后，经B16荷瘤小鼠皮下药物注射研究，证明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活体内抗癌免疫反应。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
随后，研究者对抗原工程系统的肿瘤抑制能力进行了分析。抗PD1抗体（aPD1）或化学治疗药物已与基于DFY的抗原工程系统结合用于治疗B16荷瘤小鼠（图5a）实验结果表明DFY + aPD1的治疗抑制了91％的肿瘤生长。研究者还记录了各种治疗后小鼠的存活率（图5c）。在所有组中，用DFY + aPD1处理的小鼠的存活时间最长。该结果表明，肿瘤周围注射DFY不仅可以收集可能含有肿瘤抗原的肿瘤蛋白，而且可以将免疫原性肿瘤蛋白递送至APC并引起随后的CTL激活以抑制肿瘤进展。酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，DFY + aPD1处理后，包括干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）在内的免疫激活标记物增加（图5f）。
6. DFY经皮给药治疗黑色素瘤。
研究者将凝胶状的DFY @ gel作为一种透皮治疗系统，粘附在皮肤上时释放DFY。如图6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治疗的肿瘤的平均荧光强度（MFI）高于DFY。使用V-C扩散池和荧光光谱仪研究了分离的猪皮中DFY @ gel的透皮吸收。与游离DFY相比，DFY @ gel的透皮渗透提高了1.5倍（图6h）。然后通过测量肿瘤体积评估DFY @ gel抑制肿瘤生长的能力（图6i）。在为期16天的实验中，DFY @ gel显示出与DFY（腹膜内注射）相似的治疗效果。IFN-α在临床上用于术后黑色素瘤的治疗。与临床方案相比，评估了DFY @ gel的治疗效果。IFN-α和经皮凝胶治疗均显着抑制了肿瘤的复发。该结果表明透皮DFY @ gel在预防黑素瘤复发方面具有与临床上使用的IFN-α几乎相同的治疗效果。
四、小结
在这项研究中，研究者设计了一种基于肽的肿瘤蛋白工程系统，该系统对黑素瘤治疗表现出强大的免疫原性。一旦进入恶性黑色素瘤细胞，该三肽进行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同时，通过迈克尔加成反应还捕获了来自细胞核，线粒体和核糖体的高免疫原性功能蛋白，这引起了类似于坏死的快速细胞死亡。随后，肿瘤蛋白交联的pDFY从垂死和破裂的癌细胞中释放出来，形成的聚集纤维更易于被APC内吞。因此，设计的肿瘤蛋白质工程系统成功地收集了免疫原性蛋白质并将其递送至APC，并表现出辅助作用以增强免疫应答以消除肿瘤。DFY的经皮免疫疗法在小鼠和小型猪模型中也显示出高效率和高生物相容性，并显着延长了肿瘤小鼠的存活时间。在可切除的黑色素瘤中，发现DFY@gel具有与临床IFN-α治疗相似的复发预防效果。
了解金开瑞iTRAQ定量蛋白质组学技术：https://t.cn/A6V4xP7Y
#2021巴菲特股东大会#【#巴菲特股东大会#来袭 七大重磅看点前瞻】美东时间5月1日下午1:30（北京时间5月2日凌晨1:30），伯克希尔哈撒韦公司2021年年度股东大会将于在洛杉矶举行。和2020年一样，2021年年会依旧是虚拟会议，不过伯克希尔乐观地预计，2022年的会议将回归到真人会议。
在1:30至5:00的三个半小时内，伯克希尔哈撒韦公司董事长兼CEO沃伦•巴菲特(Warren Buffett)和他的“黄金搭档”查理•芒格(Charlie Munger)将回答投资者疑问，并分享其关于商业和经济的精辟观点。伯克希尔哈撒韦副董事长格雷格·阿贝尔（Greg Abel）及阿吉特·贾恩（Ajit Jain）也将上台回答相关领域的问题。
关于本届股东大会，我们整理了七大关键话题，值得投资者重点关注。
1.伯克希尔如何重新跑赢大盘？
随着伯克希尔逐渐成长为拥有数千亿美元的投资规模和约35万名员工公司，它已经成为美股市场上最大的公司之一。但这一规模实际上也给巴菲特带来了挑战：在这样的规模下，管理伯克希尔就像开动一艘油轮而非快艇，跑赢大盘变得越发困难。
尽管在1965年至2020年期间，伯克希尔的资产每年回报率为20%。综合来看，伯克希尔的长期回报率仍然远超标普500指数等基准指数。
但2020年，伯克希尔的市值增速仅为增幅只有2.4%，而标普500指数的增幅高达18.4%，伯克希尔大幅跑输16个百分点。事实上，这已经是伯克希尔连续第二年跑输标普500指数。
拖累“股神”表现的一方面是巴菲特在2016年收购Precision Castparts（PCC）失败造成的约110亿美元的资产价值减记，另一方面，是巴菲特未能如众人所期待的那样，在去年3月美股暴跌时践行“别人恐惧我贪婪”的投资理念，错失了一些投资机会。
2020年，“股神”在投资市场上出手颇为谨慎。尽管手握巨额现金储备，但伯克希尔哈撒韦全年却净卖出了80亿美元股票，包括一批石油股、航空股及高盛、摩根大通等公司，引来不少争议。
在本次伯克希尔股东大会上，投资者期待了解巴菲特如何评价自己在2020年的表现，以及巴菲特和芒格的投资理念和策略是否发生转变。接下来，巴菲特是会继续等待还是重仓出击？
2.“大手笔”回购还会持续吗？
据今年2月伯克希尔公司披露的2021年致股东公开信显示，2020年全年，伯克希尔回购股票规模达到史无前例的247亿美元。而据外媒估计，伯克希尔今年前三个月又回购了大约50亿美元的股票。
在股东信中，巴菲特表示，之所以进行回购，是因为这可以在提高股东每股内在价值的同时，使得伯克希尔拥有比可能面对机会或问题所需求的更多资金。他还强调，公司只有在认为股票交易价格低于其内在价值时才会进行股票回购。
今年伯克希尔股A类股上涨了17%，涨幅超过了标普500指数的11%。投资者期待看到，随着伯克希尔股价持续上涨，巴菲特今年第一季度究竟回购了多少股票，从中可直观判断股神是否认为伯克希尔股价目前仍被低估。
3.如何看待科技股未来发展？
在过去，巴菲特曾多次表示自己不会购买科技股，因为看不懂科技公司是怎么赚钱的，但近年来，巴菲特和芒格的投资观念显然有了转变 ：最明显的就是伯克希尔哈撒韦的第一大重仓股已经是科技股龙头苹果。
而事实证明这一转变是正确的：单单去年苹果就大涨82%，为伯克希尔贡献了不少投资收益。
去年9月，云计算公司Snowflake上市时，伯克希尔哈撒韦买入了2.5亿美元股票，这也一度引起市场热议，因为伯克希尔在过去54年从未“打新”过。可见科技股的高回报率让巴菲特也不得不“真香”了
“股神”目前对于科技股的态度究竟如何？今年2月以来，苹果等科技股一度遭遇回调，“股神”会如何看待科技股的后市发展？
4.如何看待比特币？
在过去，巴菲特一直对比特币嗤之以鼻，认为比特币没有内在价值，热炒比特币不过是投机而非投资。
然而今年以来，比特币涨势一骑绝尘，足足翻了五倍有余，一度升至6万美元上方的历史新高，市值甚至超过了伯克希尔公司。
随着比特币不断疯长，已经有不少此前唱空比特币的华尔街名人转为唱多，就连包括高盛、摩根大通在内的金融机构也开始拥抱数字货币，准备向财富管理客户推出数字货币投资通道。
与此同时，近期声名鹊起的“华尔街女股神”凯西·伍德和“正版股神”巴菲特对于比特币持完全相反的看法，她不仅力挺比特币，更在“数字货币第一股”Coinbase上市后不断买入，可谓数字货币的头号粉丝。
在这一背景下，一向对比特币深恶痛绝的“股神”又是否会转变对比特币的看法？
5.如何评价投机狂热事件？
今年年初的美股散户逼空华尔街，爆买GME等股票的事件引起了全球轰动。而今年3月，韩裔对冲基金经理Bill Hwang管理管理的高杠杆基金Archegos Capital爆仓，引发全球多家金融机构遭受巨额损失，其中瑞信第一季度已经计提44亿瑞郎（约合47亿美元）坏账，野村也因此损失逾3000亿日元（约合27亿美元）。
今年2月24日，芒格出席他旗下报业公司Daily Journal的股东大会时，针对美股市场上的投机狂热，他深刻评论道：“在我数十年的投资生涯中见证了太多的市场疯狂，我的应对方式就是静观其变——这也正是投资者应该采取的方式 ；但是很多投资者会拥向人潮 ，购买股票，加入狂欢，甚至不惜加杠杆，这和赌博没什么两样。”
在本次股东大会上，巴菲特和芒格是否会对这些热点事件进行深度点评？此外，在后疫情时代，美股已连创历史新高。然而，广受欢迎的“巴菲特指标(美股总市值/美国GDP)”已经高达204%，早早就响起了红色警报，巴菲特认为美股中存在多少投机的泡沫？
6.巴菲特会宣布金融帝国接班者吗？
巴菲特今年已经91岁，而他的“老搭档”芒格今年已经97岁。鉴于两人年事已高，伯克希尔“继承者”问题已经成为近几年被频频问及的问题。
尽管两人始终对此避而不谈，但众人普遍预计，本次陪同巴菲特和芒格登台的伯克希尔副董事长格雷格·阿贝尔及阿吉特·贾恩就是这个六千亿金融金融帝国的未来接班人选。
在去年的股东大会上，芒格意外缺席，改由阿贝尔登台陪同巴菲特出席，一时引起了市场热议。
阿贝尔主要专注于能源和其他非保险业务，而贾恩则专注于保险业务。
在2021年巴菲特致股东信中，巴菲特写道：“伯克希尔已经为我和芒格的离开做好了全部准备。”对此，有人猜测这可能暗示在今年的股东大会上，巴菲特将公布退休计划和回应接班人问题。
7.对于中国投资机会怎么看？
“中国”话题也是近年来巴菲特股东大会上绕不开的话题了。
尽管在去年的股东大会上，巴菲特全程没有提及中国话题，但近年来，巴菲特和芒格不止一次表示中国市场存在不少投资机会。去年12月，芒格再次夸赞中国经济，同时还表示自己对中国头部公司也有非常成功的经验，这可能会持续下去。
芒格此前投资比亚迪为伯克希尔哈撒韦赚了逾50亿美元，12年大赚逾20倍。而今年第一季度，芒格管理的报社Daily Journal重仓新进16.5万股阿里巴巴股票，持仓市值3748.3万美元。
阿里巴巴股价自去年10月高点至今一度跌超30%，从买入时机来看芒格无疑是抄了个大底。
在本次股东大会上，芒格会否更具体地解释自己对阿里巴巴的投资？巴菲特和芒格将如何评价中国经济和中国未来的投资机会？中国投资者或许会尤其关注这一话题。（财联社）
在1:30至5:00的三个半小时内，伯克希尔哈撒韦公司董事长兼CEO沃伦•巴菲特(Warren Buffett)和他的“黄金搭档”查理•芒格(Charlie Munger)将回答投资者疑问，并分享其关于商业和经济的精辟观点。伯克希尔哈撒韦副董事长格雷格·阿贝尔（Greg Abel）及阿吉特·贾恩（Ajit Jain）也将上台回答相关领域的问题。
关于本届股东大会，我们整理了七大关键话题，值得投资者重点关注。
1.伯克希尔如何重新跑赢大盘？
随着伯克希尔逐渐成长为拥有数千亿美元的投资规模和约35万名员工公司，它已经成为美股市场上最大的公司之一。但这一规模实际上也给巴菲特带来了挑战：在这样的规模下，管理伯克希尔就像开动一艘油轮而非快艇，跑赢大盘变得越发困难。
尽管在1965年至2020年期间，伯克希尔的资产每年回报率为20%。综合来看，伯克希尔的长期回报率仍然远超标普500指数等基准指数。
但2020年，伯克希尔的市值增速仅为增幅只有2.4%，而标普500指数的增幅高达18.4%，伯克希尔大幅跑输16个百分点。事实上，这已经是伯克希尔连续第二年跑输标普500指数。
拖累“股神”表现的一方面是巴菲特在2016年收购Precision Castparts（PCC）失败造成的约110亿美元的资产价值减记，另一方面，是巴菲特未能如众人所期待的那样，在去年3月美股暴跌时践行“别人恐惧我贪婪”的投资理念，错失了一些投资机会。
2020年，“股神”在投资市场上出手颇为谨慎。尽管手握巨额现金储备，但伯克希尔哈撒韦全年却净卖出了80亿美元股票，包括一批石油股、航空股及高盛、摩根大通等公司，引来不少争议。
在本次伯克希尔股东大会上，投资者期待了解巴菲特如何评价自己在2020年的表现，以及巴菲特和芒格的投资理念和策略是否发生转变。接下来，巴菲特是会继续等待还是重仓出击？
2.“大手笔”回购还会持续吗？
据今年2月伯克希尔公司披露的2021年致股东公开信显示，2020年全年，伯克希尔回购股票规模达到史无前例的247亿美元。而据外媒估计，伯克希尔今年前三个月又回购了大约50亿美元的股票。
在股东信中，巴菲特表示，之所以进行回购，是因为这可以在提高股东每股内在价值的同时，使得伯克希尔拥有比可能面对机会或问题所需求的更多资金。他还强调，公司只有在认为股票交易价格低于其内在价值时才会进行股票回购。
今年伯克希尔股A类股上涨了17%，涨幅超过了标普500指数的11%。投资者期待看到，随着伯克希尔股价持续上涨，巴菲特今年第一季度究竟回购了多少股票，从中可直观判断股神是否认为伯克希尔股价目前仍被低估。
3.如何看待科技股未来发展？
在过去，巴菲特曾多次表示自己不会购买科技股，因为看不懂科技公司是怎么赚钱的，但近年来，巴菲特和芒格的投资观念显然有了转变 ：最明显的就是伯克希尔哈撒韦的第一大重仓股已经是科技股龙头苹果。
而事实证明这一转变是正确的：单单去年苹果就大涨82%，为伯克希尔贡献了不少投资收益。
去年9月，云计算公司Snowflake上市时，伯克希尔哈撒韦买入了2.5亿美元股票，这也一度引起市场热议，因为伯克希尔在过去54年从未“打新”过。可见科技股的高回报率让巴菲特也不得不“真香”了
“股神”目前对于科技股的态度究竟如何？今年2月以来，苹果等科技股一度遭遇回调，“股神”会如何看待科技股的后市发展？
4.如何看待比特币？
在过去，巴菲特一直对比特币嗤之以鼻，认为比特币没有内在价值，热炒比特币不过是投机而非投资。
然而今年以来，比特币涨势一骑绝尘，足足翻了五倍有余，一度升至6万美元上方的历史新高，市值甚至超过了伯克希尔公司。
随着比特币不断疯长，已经有不少此前唱空比特币的华尔街名人转为唱多，就连包括高盛、摩根大通在内的金融机构也开始拥抱数字货币，准备向财富管理客户推出数字货币投资通道。
与此同时，近期声名鹊起的“华尔街女股神”凯西·伍德和“正版股神”巴菲特对于比特币持完全相反的看法，她不仅力挺比特币，更在“数字货币第一股”Coinbase上市后不断买入，可谓数字货币的头号粉丝。
在这一背景下，一向对比特币深恶痛绝的“股神”又是否会转变对比特币的看法？
5.如何评价投机狂热事件？
今年年初的美股散户逼空华尔街，爆买GME等股票的事件引起了全球轰动。而今年3月，韩裔对冲基金经理Bill Hwang管理管理的高杠杆基金Archegos Capital爆仓，引发全球多家金融机构遭受巨额损失，其中瑞信第一季度已经计提44亿瑞郎（约合47亿美元）坏账，野村也因此损失逾3000亿日元（约合27亿美元）。
今年2月24日，芒格出席他旗下报业公司Daily Journal的股东大会时，针对美股市场上的投机狂热，他深刻评论道：“在我数十年的投资生涯中见证了太多的市场疯狂，我的应对方式就是静观其变——这也正是投资者应该采取的方式 ；但是很多投资者会拥向人潮 ，购买股票，加入狂欢，甚至不惜加杠杆，这和赌博没什么两样。”
在本次股东大会上，巴菲特和芒格是否会对这些热点事件进行深度点评？此外，在后疫情时代，美股已连创历史新高。然而，广受欢迎的“巴菲特指标(美股总市值/美国GDP)”已经高达204%，早早就响起了红色警报，巴菲特认为美股中存在多少投机的泡沫？
6.巴菲特会宣布金融帝国接班者吗？
巴菲特今年已经91岁，而他的“老搭档”芒格今年已经97岁。鉴于两人年事已高，伯克希尔“继承者”问题已经成为近几年被频频问及的问题。
尽管两人始终对此避而不谈，但众人普遍预计，本次陪同巴菲特和芒格登台的伯克希尔副董事长格雷格·阿贝尔及阿吉特·贾恩就是这个六千亿金融金融帝国的未来接班人选。
在去年的股东大会上，芒格意外缺席，改由阿贝尔登台陪同巴菲特出席，一时引起了市场热议。
阿贝尔主要专注于能源和其他非保险业务，而贾恩则专注于保险业务。
在2021年巴菲特致股东信中，巴菲特写道：“伯克希尔已经为我和芒格的离开做好了全部准备。”对此，有人猜测这可能暗示在今年的股东大会上，巴菲特将公布退休计划和回应接班人问题。
7.对于中国投资机会怎么看？
“中国”话题也是近年来巴菲特股东大会上绕不开的话题了。
尽管在去年的股东大会上，巴菲特全程没有提及中国话题，但近年来，巴菲特和芒格不止一次表示中国市场存在不少投资机会。去年12月，芒格再次夸赞中国经济，同时还表示自己对中国头部公司也有非常成功的经验，这可能会持续下去。
芒格此前投资比亚迪为伯克希尔哈撒韦赚了逾50亿美元，12年大赚逾20倍。而今年第一季度，芒格管理的报社Daily Journal重仓新进16.5万股阿里巴巴股票，持仓市值3748.3万美元。
阿里巴巴股价自去年10月高点至今一度跌超30%，从买入时机来看芒格无疑是抄了个大底。
在本次股东大会上，芒格会否更具体地解释自己对阿里巴巴的投资？巴菲特和芒格将如何评价中国经济和中国未来的投资机会？中国投资者或许会尤其关注这一话题。（财联社）
#安心变美课堂# [太阳]大白主任分享小妙招。
针对问题：细纹，这是个令人头疼的问题[思考]
小建议：外用局部类维生素A。维生素A自然存在于皮肤中，衰老导致的维生素A（一种视黄醇）的逐渐丢失，可通过局部类视黄醇等维生素A衍生物来补充，因此可以在柜台购买局部类维生素A，例如视黄淳和阿达帕林。
研究显示，长期使用类维生素A，可增加皮肤胶原蛋白的厚度，进而显著改善细纹。类维生素A的其他好处包括改善黑斑和减少可能导致皮肤癌的非典型皮肤细胞。（不要大量使用哦）
注意事项：局部类维生素A最常见的副作用有干燥、发红、刺激和脱皮，可通过逐渐增加使用量（从每隔三夜到隔夜，再到每晚）或避免与其他潜在刺激性产品一起使用减少副作用的几率。如果您在备孕或正在怀孕或哺乳，请避免使用局部类维生素A。另外，由于局部类维生素A提高了皮肤对阳光的敏感性，需配合使用SPF 30+以上的防晒霜。
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小建议：外用局部类维生素A。维生素A自然存在于皮肤中，衰老导致的维生素A（一种视黄醇）的逐渐丢失，可通过局部类视黄醇等维生素A衍生物来补充，因此可以在柜台购买局部类维生素A，例如视黄淳和阿达帕林。
研究显示，长期使用类维生素A，可增加皮肤胶原蛋白的厚度，进而显著改善细纹。类维生素A的其他好处包括改善黑斑和减少可能导致皮肤癌的非典型皮肤细胞。（不要大量使用哦）
注意事项：局部类维生素A最常见的副作用有干燥、发红、刺激和脱皮，可通过逐渐增加使用量（从每隔三夜到隔夜，再到每晚）或避免与其他潜在刺激性产品一起使用减少副作用的几率。如果您在备孕或正在怀孕或哺乳，请避免使用局部类维生素A。另外，由于局部类维生素A提高了皮肤对阳光的敏感性，需配合使用SPF 30+以上的防晒霜。
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